Подбор мультиэнзимного комплекса для снижения содержания антипитательных веществ в зеленой массе амаранта

В последние годы остро стоит вопрос усовершенствования кормовой базы птицеводства с целью повышения продуктивности и устойчивости к бактериальным инфекциям [1,11,19,20]. Одной из перспективных кормовых культур является амарант, имеющий уникальный химический состав [16]. В зеленой массе амаранта

в пересчете на абсолютно сухой вес содержится, %: сырого протеина 15,6–16,75 (в листьях до 30), жира – 2,4–2,8, клетчатки – 16,0–21,7, кальция 2,1–2,6, фосфора 0,2–0,21, каротина 160–200 мг [2, 3, 14]. Включение амаранта в состав рационов птицы оказывает положительное влияние на продуктивность, сохранность и физиологическое состояние. Выштакалюк А.С., Хируг С.С. установили, что употребление

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License фитомассы амаранта в чистом виде вызывает некоторое ухудшение состояния птиц [4, 5]. Это может быть вызвано превышением уровня клетчатки, избыточным содержанием некоторых аминокислот в составе рациона или присутствием антипитательных веществ в составе растения. Однако, на сегодняшний день информация о содержании антипитательных веществ в зеленой массе амаранта противоречива. Известны различные способы деструкции антипи-тательных веществ: процессы мацерации, водно-и водно-спиртовой обработки, в том числе бланширования, экстракции углеводородами, или введения наполнителей, нейтрализующих их негативное действие [6]. Однако одним из приоритетных направлений в производстве кормовых добавок является биоконверсия растительного сырья с помощью ферментативного гидролиза.

Цель работы – подбор мультиэнзимного комплекса для получения высокобелковой кормовой добавки из зеленой массы амаранта с максимально сниженным содержанием анти-питательных веществ.

Материалы и методы

Объектом исследования являлась зеленая масса амаранта сорта «Гигант» (Amaranthus hypochondriacus), урожай 2022 г.

Химический состав зеленой массы амаранта определяли: содержание первоначальной влаги методом высушивания, ГОСТ 1396.3–92; сырой золы, ГОСТ 26226–95; сырого протеина методом Кьельдаля, ГОСТ 13496.15–94; сырого жира экстрагированием бензином по Сокслету, ГОСТ 13496.95; сырой клетчатки по Геннебергу и Штоману (модификация), ГОСТ 1396.2–91, безазотистистые экстрактивные вещества – расчётным методом.

Подготовку проб для определения анти-питательных веществ проводили путем приготовления вытяжек используя зелёную часть амаранта. Надземную часть амаранта предварительно измельчали до размеров 2–3 мм. Взвешивали 50 г. образца, тщательно перетирали в ступке с кварцевым песком, количественно переносили в колбу на 500 см3, заливали 450 см3 дистиллированной воды и настаивали в течение 24 ч при температуре 25 °С. Полученную смесь фильтровали и использовали для определения содержания антипитательных веществ: количество нитратов в соответствии с ГОСТ 13496.19–2015, щавелевой кислоты – МУ 1808–77, танинов – ГОСТ 19885–74. Содержание фитатов контролировали согласно методике, описанной в Патенте РФ 2018102663, ингибиторы трипсина – ГОСТ 33427–2015, сапонины – согласно методике, описанной в Патенте РФ 2413951, нитраты и нитраты – ГОСТ 13496,19–2015.

Для ферментативного гидролиза были использованы коммерчески доступные препараты, обладающие фитазной активностью:

• 1.    ФИДБЕСТ® - Р (Ф-1) - монофосфатаз-ный препарат, с фитазной актавностью 10000 ед/г. Сохраняет активность в течение 4 часов активность в диапозоне рН 3,0-7,0.

• 2.    ФИДБЕСТ® - WP 20000 (МЭП-1) -ферментный комплекс, имеющий ксиланазную активность не менее 20000 ед/г, β-глюканазную -не менее 7000 ед/г, фитазную - не менее 10000 ед/г. Производитель компания «Сиббиофарм».

• 3.    «Санфайз 10 000 L фитаза» (Ф-2) - мо-нофосфатазный препарат, с фитазной актавностью не менее 10 000 ФЕ/г. Производитель компания «Wuhan Sunhy Biology».

• 4.    Агрофит 5000 (Ф-3) – монофосфатазный препарат, фитазная активность не менее 5000 ед/г. Производитель компания «Агрофермент».

• 5.    КЕМЗАЙМ® плюс Р сухой (МЭП-2) – мультэнзимный препарат, проявляет ксиланазную, бета-глюканазнаю, целлюлазную активности, амилазную, протеазную и фитазную активности. Производитель компания «KEMIN».

Результаты и обсуждение

В ходе исследований установлено (таблица 1), что зеленая масса амаранта богата питательными веществами, отличается высоким содержанием сырого протеина 14,89%, сырой клетчатки 23,10%.

Таблица 1.

Химический состав зеленой массы амаранта

Table 1.

Chemical composition of the green mass of amaranth

Показатель Indicator	Содержание, % Content, %	Показатель Indicator	Содержание, % Content, %
Гигровлага | Hygro moisture	4,80	Сырая зола | Crude ash	11,15
Общий азот | Total nitrogen	2,39	Кальций, мг | Calcium, mg	1660,00
Сырой протеин | Crude protein	14,89	Фосфор, мг | Phosphorus, mg	450,00
Сырой жир | Сrude fat	4,33	Рибофлавин, мг | Riboflavin В 2, mg	2,00
Сырая клетчатка | Сrude fiber	23,10	Витамин С, мг | Vitamin С, mg	4,20
Безазотистистые экстрактивные в-ва | Nitrogen-free extractive substances	43,62	Витамин Е, мг | Vitamin Е, mg	1,19

Таблица 2.

Содержание антипитательных веществ в фитомассе амаранта

Table 2.

The content of anti-nutritional substances in the green mass of amaranth

Антипитательный компонент Anti-nutritional substance	Количественное содержание, мг/100 г. Quantitative content, mg/100 g
Щавелевая к-та Oxalic acid	79
Танины | Tannins	75
Фитиновая кислота Phytic acid	156
Нитраты | Nitrates	74
Ингибиторы трипсина Trypsin inhibitors	0
Сапонины | Saponins	0

Однако кроме питательных компонентов в амаранте содержатся антипитательные вещества, накапливающиеся в период роста и развития растения [15]. По литературным данным в фитомассе амаранта содержатся танины, фитиновая кислота, ингибиторы трипсина, нитраты и сапонины, которые ухудшают перевариваемость корма, снижают его конверсию, продуктивность птицы и качество продукции [6, 7, 12, 13, 17]. В связи с этим, нами был изучен состав антипитательных веществ зеленой части амаранта. В ходе наших исследований установлено (таблица 2), что в зеленой массе амаранта присутствуют: щавелевая кислота, танины, нитраты и фитаты, ингибиторы трипсина и сапонины отсутствуют.

Анализ антипитатательных компонентов зеленой массы амаранта показал, что содержание фитиновой кислоты и ее солей в амаранте в 1,5–2 раза выше, чем в чечевице, кормовых бобах и пшенице, но ниже по сравнению с соей, фасолью и люпином. Количество танинов, щавелевой кислоты и нитратов не значительно. Содержание щавелевой кислоты в данном сорте амаранта в 6–7 раз ниже, чем в зеленой массе вики (0,50–0,8%) и в 12 раз – овса (1%). [8, 18] Кроме того, наиболее эффективный способ ее выделения, позволяющий извлечь 83% кислоты предусматривает двукратную обработку растительного сырья СВЧ-энергией в течение 5 мин с интервалом в 3 мин, с последующей экстракций дистиллированной водой при температуре 70–80 °С в течение 10 мин. Что может способствовать снижению питательной ценности зеленой массы амаранта за счет разрушения витаминов. Количество танинов и нитратов не превышает предельно допустимые концентрации 500 мг / 100 г. и 200 мг / 100 г. соответственно.

Поэтому разрабатывать способы их удаления из амаранта не целесообразно, кроме того присутствие танинов в небольшом количестве в кормах препятствует развитию тимпании.

Наиболее эффективным способом деструкции фитатов является ферментативная обработка. При действии фитазы снижается концентрация свободной фитиновой кислоты и её низших фосфатных эфиров – анионов ИФ 5-4 , оказывающих негативное влияние на пищеварение и всасывание питательных веществ. Известно, что фитаты в кормах присутствуют не в чистом виде, а в виде глобул, включающих крахмал и протеин, которые ограничивают действие фитаз. Расщепление глобул протеазами и карбогидразами может облегчать доступность фитаз к субстрату, повышая эффективность их действия [9,10]. В связи с этим был проведен эксперимент определения эффективности влияния промышленных ферментных препаратов (таблица 3) на деструкцию фитиновой кислоты.

Свежескошенную массу амаранта измельчали на ножевой мельнице до размера частиц 1–2 мм, смешивали с цитратным буфером в соотношении 1:10. Ферментативный гидролиз осуществляли при температуре 30 ± 1 °С, рН 4,5 в течение 60 мин. Концентрация ферментного препарата в каждом образце составляла 0,1 мг/г сырья. В процессе гидролиза контролировали остаточное содержание фитиновой кислоты.

Таблица 3.

Влияние ферментных препаратов фитазы на степень деструкции фитиновой кислоты и ее солей в зеленой массе амаранта

Table 3.

The effect of enzyme preparations of phytase on the degree of destruction of phytic acid and its salts in the green mass of amaranth

Ферментный препарат Enzyme preparation	Остаточное содержание фитиновой кислоты и ее солей, % от максимального Residual content of phytic acid and its salts, % of the maximum
ФИДБЕСТ® – Р – 10000 (Ф-1) FEEDBEST® – Р – 10000	83,96
ФИДБЕСТ® – WP 20000 (МЭП-1) FEEDBEST ® – WP 20000	73,72
«Санфайз 10 000 L фитаза» (Ф-2) «Sanfayz 10 000 L phytase»	83,33
Агрофит 5000 (Ф-3) Agrofit 5000	91,02
КЕМЗАЙМ® плюс Р сухой (МЭП-2) КЕМZYМЕ ® plus Р dry	64,7

Все исследуемые ферментные препараты проявляли активность в отношении фитатов зеленой массы амарант. Наибольше снижение количества фитатов наблюдали при использовании мультиэнзимных препаратов МЭП-1 и МЭП-2, содержащих не только фитазу, но и ксиланазу, β-глюканазу, нарушающих целостность оболочек клеток, препятствующих доступности гидролаз к питательным веществам цитоплазмы, в том числе и фитатов. Наибольшее влияние на снижение фитатов в зеленой массе амаранта проявлял МЭП-2, дополнительно содержащий ферменты протеазу и амилазу, способствующие разрушению комплексов фитатов с крахмалом и протеином.

На эффективность действия ферментов значительное влияние оказывают рН, температура и дозировка препаратов.

Изучение влияния дозировки МЭП-2 на снижение содержания фитиновой кислоты

Изучение влияния рН на эффективность действия фитазы (рисунок 2) проводили при оптимальной дозировке мультиэнзимного препарата 0,5 мг/г сырья при температуре 30 °С в течение 1 ч. Установлено, что фермент проявляет высокую способность к деструкции фитиновой кислоты во всем исследуемом диапазоне рН, но наибольшее эффективна обработка зеленой массы амаранта при рН 6,5.

Выбор оптимальных режимов гидролиза фитатов зеленой массы амаранта мультиэнзимным комплексом (рисунок 3) показал, что наибольшее снижение фитатов наблюдается при дозировке МЭП-2 0,5–0,6 мг/г сырья, температуре 45 °С, рН 6,5 в течение 3–4 ч. Однако, для сохранения ценных компонентов зеленной массы амаранта нагревать ее выше 40 °С не рекомендуют.

Рисунок 1. Влияние дозировки мультиферментного препарата МЭП-2 на содержание фитиновой кислоты в зеленой массе амаранта: Ф – содержание фитатов, % от максимального; τ – продолжительность гидролиза, ч, n – дозировка ферментных препаратов, мг/г

Figure 1. The effect of the dosage of the multi-enzyme preparation MEP-2 on the content of phytic acid in the green mass of amaranth: P – the content of phytates, % of the maximum; τ – duration of hydrolysis, h, n – dosage of enzyme preparations, mg/g

Рисунок 2. Влияние рН на содержание фитиновой кислоты и ее солей в процессе ферментативной обработки зеленой массы амаранта: Ф – содержание фитатов, % от максимального

Figure 2. The effect of рН on the content of phytic acid and its salts in the process of enzymatic treatment of amaranth green mass: P is the content of phytates, % of the maximum

Рисунок 3. Динамика гидролиза фитатов зеленой массы амаранта мультиэнзимным препаратом МЭП-2 при дозировке 0,5 мг/г сырья: Ф – содержание фитатов, % от максимального; τ – продолжительность гидролиза, мин, t – температура гидролиза, °С

Figure 3. Dynamics of hydrolysis of phytates of amaranth green mass by multienzyme preparation MEP-2 at a dosage of 0.5 mg/g of raw materials: P – phytate content, % of maximum; τ – duration of hydrolysis, min, t – hydrolysis temperature, °C

Таким образом, для снижения количества фитиновой кислоты и ее солей в зеленой массе

амаранта ферментативную обработку необходимо проводить мультиэнзимным комплексом КЕМЗАЙМ® плюс Р сухой (МЭП-2) в количестве 0,5 мг/г сырья, при рН 6,5 и температуре 40 °С течение 3 ч, что позволит снизить содержание фитатов на 90%.

Заключение

Установлено, что в зеленой массе амаранта присутствуют: щавелевая кислота (79мг/ 100 г.), танины (75 мг/ 100 г.), нитраты (74 мг/ 100 г.) и фитаты (156 мг/ 100 г.), ингибиторы трипсина и сапонины отсутствуют. Наиболее эффективным способом деструкции фитатов является ферментативная обработка. Наибольшее влияние на снижение фитатов в зеленой массе амаранта оказал ферментативный комплекс КЕМЗАЙМ® плюс Р сухой, дополнительно содержащий ферменты протеазу и амилазу, способствующие разрушению комплексов фитатов с крахмалом и протеином. Ферментативную обработку мультиэнзимным комплексом необходимо проводить в количестве 0,5 мг/г сырья, при рН 6,5 и температуре 40 °С в течение 3 ч, что позволяет снизить содержание фитатов на 90%.

Работа выполнена в рамках гранта РНФ № 22–76–00062.