Подбор оптимальной методики выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaria для проведения ПЦР

The different methods of DNA isolation from mycelium of fungi of Alternaria Nees species cultivated on different mediums were compared. The optimal appeared to be DNA isolation by means of commercial reagents QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Germany). The method of Zolan and Pukkila (1986) modified with application of Al 2 O 3 at the stage of homogenization is also suitable. There are isolated six ISSR-primers initiating amplification of polymorphous DNA fragments in Alternaria Nees species which are observed on sunflower in Krasnodar region. These ISSR-loci can be used for studying of inter- and intraspecific variability of fungi of Alternaria species .

Род Alternaria Nees представляет собой большую и разнообразную по биологическим характеристикам группу микромице-тов, многие из которых распространены очень широко. В частности, описаны 11 видов этого рода, паразитирующих на подсолнечнике, способных инфицировать как растения, так и семена [1; 2]. Идентификация многих видов Alternaria вызывает ряд трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов, внутривидовая вариабельность признаков, номенклатурная путаница и отсутствие полноценных русскоязычных определительных ключей, учитывающих современную систематику рода.

В ходе исследования часто не удается определить вид некоторых изолятов по морфологическим признакам. Для достоверной идентификации таких изолятов необходимо применение современных молекулярных методов анализа ДНК гриба. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет преодолеть эти трудности , однако эффективность данного методического приема напрямую зависит от способа выделения ДНК из клеток.

Клеточная стенка грибов состоит из нескольких слоев содержащих белки в форме ковалентно связанных с углеводами гликопротеинов, глюканов и хитина, это и определяет сложности в экстракции ДНК. Из-за недостаточной очистки препаратов ДНК от белков полимеразная цепная реакция может блокироваться полностью или частично, т.е. результаты могут быть невоспроизводимы.

Целью данной работы было оптимизировать методику выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaria , выращенного на разных питательных средах, и выявить стабильный, воспроизводимый полиморфизм амплифицированных фрагментов, пригодных для создания системы молекулярных маркеров и идентификации разных видов патогена, встречающихся на подсолнечнике в Краснодарс-ком крае.

Материал и методы. Объектом исследований послужили 30 образцов мицелия грибов рода Alternaria, выделенных из листьев, стеблей и семян подсолнечника. С целью изучения эффективности различных методов выделения ДНК гриба для проведения ПЦР применяли сравнительный анализ трех способов выделения: наборы QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия), Diamond DNA Plant Kit D (Россия), метод основанный на использовании лизирующего буфера, содержащего гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ) [3] с добавлением оксида алюминия и без него (табл. 1). В качестве материала для выделения ДНК использовали мицелий, выращенный на двух разных питательных средах: а) в пластиковых чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) с последующим соскабливанием; б) на жидкой среде Чапека с последующим фильтрованием.

Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли визуально по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1%-ном агарозном геле с добавлением 2 мкл бромистого этидия. Электрофорез проводили при напряжении 100–120 V в течение 40 мин.

Для ПЦР анализа применяли 12 ISSR-праймеров (табл. 2) [10].

Полимеразную цепную реакцию выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мM сульфата аммония; 1,5– 3,0 мM MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термоста- бильной ДНК-полимеразы («Сибэнзим», Россия). Реакции проводили в термоциклере S1000тм (BioRad, США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 94 °С в течение 2 мин, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 ºС в течение 60 сек, отжиг праймера при N ºС – 60 сек, элонгация при 72 ºС – 80 сек, где N – температура отжига каждого праймера – представлена в таблице 2.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в геле, содержащем 2 % агарозы и ТАЕ-буфер, с использованием камеры для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, Россия). Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция).

Таблица 1

Методы, использованные для выделения ДНК из мицелия грибов рода Alternaria

№ п/п	Вид	Метод экстракции ДНК	Питательная среда
1	A. alternata	QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия)	ср. Чапека
2	A. alternata	Diamond DNA Plant Kit D (Россия)	- // -
3	A. tenuissima	QIAGEN Dnseay Plant MiniKit	- // -
4	A. tenuissima	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
5	A. tenuissima	QIAGEN Dnseay Plant MiniKit	- // -
6	A. tenuissima	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
7	A. helianthiinficiens	QIAGEN Dnseay Plant MiniKit	- // -
8	A. helianthiinficiens	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
9	A. tenuissima	QIAGEN Dnseay Plant MiniKit	- // -
10	A. tenuissima	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
11	A. infectoia	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
12	A. infectoia	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
13	A. tenuissima	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
14	A. tenuissima	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
15	Ulocladium sp	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
16	Ulocladium sp	Diamond DNA Plant Kit D	- // -
17	A. tenuissima	СТАВ	КМА*
18	Stemphillium	СТАВ	- // -
19	A. tenuissima	СТАВ	- // -
20	Stemphillium	СТАВ	- // -
21	A. tenuissima	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
22	Alternaria sp	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
23	Alternaria sp	СТАВ, A 2 O 3	- // -
24	Alternaria sp	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
25	A. infectoia	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
26	A. tenuissima	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
27	A. infectoia	СТАВ, A 2 O 3	ср. Чапека
28	A.arborescens	СТАВ, Al 2 O 3	- // -
29	Alternaria sp	СТАВ, A 2 O 3	- // -
30	A. tenuissima	СТАВ, Al 2 O 3	- // -

*– КМА картофельно-морковный агар

Результаты и обсуждение. Для исследования по подбору оптимальной методики экстракции ДНК из мицелия гриба были выбраны два коммерческих набора реактивов: QIAGEN Dnseay Plant MiniKit (Германия), предназначенный для выделения ДНК из растений, общепризнанный «золотым стандартом» в области пробо-подготовки, и Diamond DNA Plant Kit D (Россия), созданный для выделения ДНК из засушенных растений, семян и грибов. Не удалось получить качественные препараты ДНК с использованием набора Diamond, несмотря на входящую в состав его методики обработку ферментом протеиназой К, рекомендуемой многими авторами [4–9]. Полученная ДНК не гибридизова-лась ни с одним из праймеров и в результате не удалось получить продукты реакции амплификации. На рисунке 1 представлены фореграммы с праймером GAA6 продуктов амплификации ДНК, выделенной с помощью наборов QIAGEN и Diamond. В случае экстракции с использованием набора Diamond продукты амплификации не были получены так же ни с одним из изученного набора праймеров.

Рисунок 1 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaria с праймером GAA6 при употреблении разных методик выделения:

1–5 – QIAGEN; 6–9 – Diamond. Стрелками указаны полиморфные фрагменты ДНК. М – маркер молекулярного веса; 1 – A. Alternata;

2, 3, 5 – A. tenuissima; 4 – A. Helianthiinficiens

Из четырех апробированных вариантов экстракции ДНК лучший результат удалось получить при использовании набора QIAGEN. На рисунке 2 представлена фо-реграмма продуктов амплификации ДНК, выделенной с набором QIAGEN и методом CTAB без использования оксида алюминия. Во втором варианте качество полученной ДНК было хуже, что позволило получить продукты амплификации, но при этом не было выявлено полиморфных фрагментов.

Рисунок 2 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaria с праймером GACA4 при употреблении разных методик выделения: 1–5 – QIAGEN; 6–9 СТАВ. Стрелками указаны полиморфные фрагменты ДНК. М – маркер молекулярного веса; 1 – A. Alternata;

2, 3, 5 – A. tenuissima; 4 – A. helianthiinficiens

Препараты ДНК хорошего качества удалось получить и при выделении ДНК методом СТАВ, но с добавлением оксида алюминия. Выделенная таким способом ДНК производила продукты реакции c ISSR-праймерами, и при этом были выявлены полиморфные фрагменты. Не имело значения, как выращен мицелий, – на твердых, агаризованных, или жидких средах. Таким образом, лучшего качества препараты ДНК удалось получить при использовании двух способов её выделения и очистки: с применением коммерческого набора для экстракции ДНК – QIAGEN, и с использованием СТАВ с добавлением оксида алюминия. Причем, учитывая стоимость комплекта необходимых буферов и реагентов QIAGEN, предпочтительнее применять второй способ.

Выделенные всеми четырьмя способами образцы ДНК гриба были апробированы с некоторыми универсальными праймерами, разработанными для наиболее распространенных видов Alternaria. Проведенные реакции амплификации показали, что ДНК, экстрагированная с применением набора Diamond, не производила продуктов реакции с ними и в дальнейшем ПЦР с этими образцами ДНК не проводилась. Матричная ДНК, полученная остальными методами, хорошо ги-бридизовалась со специфичными праймерами, и были получены четкие, хорошо воспроизводимые фракции, представленные на рисунке 3.

Рисунок 3 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК грибов рода Alternaria с парой праймеров AAR3, AAF2 при употреблении разных методик выделения: 1–5 – QIAGEN; 6–9 СТАВ;

10–9 – СТАВ с Al 2 O 3 . М – маркер молекулярного веса. К – отрицательный контроль

Для выявления молекулярно-генетического полиморфизма у разных видов Alternaria был проведен скрининг 12 ISSR-локусов (табл. 2). Такие простые повторяющиеся последовательности распределены по всему геному эукариот и успешно используются для выявления различий между разными видами микро-мицетов [10; 11; 12]. Как описано выше, в реакциях амплификации с этими праймерами использовалась матричная ДНК, выделенная двумя способами: набором QIAGEN и с использованием СТАВ с Al2O3. Как показано в таблице 2, из 12 проанализированных ISSR-праймеров шесть давали продукты амплификации, причем во всех случаях были выявлены полиморфные фракции у образцов ДНК разных видов гриба.

Таблица 2

Характеристика ISSR-локусов, использованных для получения полиморфных фрагментов ДНК, у грибов рода Alternaria, паразитирующих на подсолнечнике

Праймер	Последовательность праймеров 5’ – 3’	Температура отжига	Наличие или от-сутст-вие полиморфизма
CA8	CAC ACA CAC ACA CAC A	53	+
CAC5	CAC CAC CAC CAC CAC	53	Нет отжига
CT8	CTC TCT CTC TCT CTC T	50	Нет отжига
GAA6	GAA GAA GAA GAA GAA GAA	53	+
GACA4	GAC AGA CAG ACA GAC A	53	+
GATA4	GAT AGA TAG ATA GAT A	53	Нет отжига
GGAT4	GGA TGG ATG GAT GGA T	53	+
GTG5	GTC GTC GTC GTC GTC	50	+
TCC5	TCC TCC TCC TCC TCC	53	Нет отжига
TG10	TGT GTG TGT GTG TGT GTG TG	53	Нет отжига
T3B	AGG TGG GGG GTT GGA ATC C	53	Нет отжига
М13	GAG GGT GGN GGN TCT	53	+

В ходе эксперимента по ISSR-локусам GAA6 и GACA4 были выявлены полиморфные фракции ДНК у изолята A. he-lianthiinficiens. На рисунках 1 и 2 эти фракции показаны стрелками на дорожке под номером 4. По локусу GAA6 выявлено две полиморфных фракции, которых нет у изолятов A. alternata (дорожка 1) и A. tenuissima (дорожки 2, 3, 5) (рис. 1). А по локусу GACA4 выявлено три фракции, отличающие этот изолят от остальных (рис. 2). Однако при проведении ПЦР с несколькими образцами ДНК одного вида Alternaria так же обнаружены полиморфные фракции. Например, у образцов A. tenuissima, представленных на рисунках 1 и 2 (дорожки 2, 3, 5). Несмотря на это, изученные ISSR-локусы пригодны для выявления меж- и внутривидовых различий у грибов рода Alternaria.

Заключение. Таким образом, для грибов рода Alternaria, распространённых на подсолнечнике, наиболее подходящим способом выделения ДНК являются методики QIAGEN Dnseay Plant MiniKit

(Германия) и СТАВ с добавлением Al 2 O 3 на стадии гомогенизации.

Выявлены шесть ISSR-праймеров, инициирующих амплификацию полиморфных фрагментов ДНК у видов Alternaria Nees, встречающейся на подсолнечнике в Краснодарском крае.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Краснодарского края, грант №13-04-96586.