Подбор оптимальных параметров экстракции каротиноидов из бурых водорослей Fucus vesiculosus и определение антиоксидантной активности экстракта

Морские коричневые макроводоросли производят множество высокобиоактивных вторичных метаболитов со структурами, которые не встречаются в других организмах. Различные компоненты и фракции в коричневых макроводорослях имеют большой потенциал в качестве антиоксидантных пищевых добавок, подходящих для коммерческой эксплуатации. Также в их составе имеются широко распространенные красящие пигменты, относящиеся по химической 35

природе к флавоноидным и каротиноидным соединениям, которые являются основой красных, оранжевых и желтых красителей. β-каротин служит для защиты иммунной системы, профилактики гастроэнтерологических, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, известен как антиокислитель. Флавоноиды обладают антиоксидантным, капилляроукрепляющим, желчегонным, гепатопротекторным, противовирусным и антимикробным действием [1].

Натуральные пигменты (как хлорофиллы, так и каротиноиды) обладают антиоксидантной активностью [2, 3], что позволяет использовать бурые водоросли в качестве источника природных антиоксидантов. Свободные радикалы могут повреждать клетки и способствовать развитию различных заболеваний, поэтому антиоксиданты важны для поддержания здоровья и защиты организма. Чем выше процент антиоксидантной активности, тем эффективнее продукт в борьбе со свободными радикалами [4].

Каротиноиды - это семейство пигментированных соединений, которые синтезируются растениями и микроорганизмами, но не животными. Считается, что каротиноиды отвечают за полезные свойства фруктов и овощей в профилактике заболеваний человека, включая сердечно-сосудистые, рак и другие хронические заболевания [5]. Каротиноиды представляют собой важные природные пигменты, обладающие мощными антиоксидантными свойствами [6] и играющие ключевую роль в поддержании здоровья человека. Они не только способствуют защите клеток от окислительного стресса, но и участвуют в процессах фотосинтеза у растений. Каротиноиды являются источником провитамина А, способствуют здоровому цвету кожи, помогают поддерживать нормальное зрение. Также имеются достоверные доказательства улучшения когнитивных функций после приема определенных каротиноидов. Пищевая добавка Е 160 – каротин - придает продуктам оранжевый цвет.

Натуральные антиоксиданты – это соединения, которые вызвали большой интерес, так как могут заменить синтетические антиоксиданты в продлении срока хранения продуктов питания и косметики, задерживая окисление. Они также могут придать продукту ценные свойства, действуя против заболеваний, связанных с окислением, старения и воздействия ультрафиолета на кожу. Одним из способов регулирования адаптационного уровня организма человека является доставка нутриентов, обладающих антиоксидантными свойствами [7]. В последние годы были предложены биологически активные соединения морских водорослей для получения нутрицевтиков и функциональных продуктов питания.

Морские водоросли обычно делятся на три группы в зависимости от их пигментации: коричневые ( Phaeophyceae ), красные ( Rhodophyceae ) и зеленые ( Chlorophyceae ). Сообщалось, что Phaeophyta содержат сравнительно более высокое количество и более активные антиоксиданты, чем зеленые и красные водоросли [8, 9]. Пигменты водорослей, участвующие в процессах фотосинтеза, могут быть использованы в качестве биологически активного вещества с антиоксидантными свойствами. В последние годы изучение антиоксидантных свойств каротиноидов было основным направлением исследований [10, 11]. Например, фукоксантин, являющийся основным каротиноидом, производимым бурыми водорослями, оказывает противоопухолевую активность, ингибирует рост раковых клеток [12]. В настоящее время фукоксантин считается безопасной добавкой Европейским управлением по безопасности пищевых продуктов.

Одним из перспективных источников каротиноидов являются бурые водоросли, среди которых особое внимание привлекает вид Fucus vesiculosus (рис. 1).

Этот вид водорослей широко распространен в северных морях и обладает уникальным химическим составом, что делает его ценным объектом для исследований. F. Vesiculosus часто характеризуется как самый важный из всех фитобентических видов в прибрежной зоне Балтии. Это связано с его широким распространением и высокой скоростью набора биомассы. Этот вид обитает вдоль скалистых и каменистых берегов, где играет важную структурную роль и оказывает положительное влияние на биоразнообразие [13].

Фукус пузырчатый является устойчивым ресурсом, который может быть собран с минимальным воздействием на окружающую среду. Его использование в качестве источника каротиноидов может способствовать развитию устойчивых практик в аквакультуре и морском хозяйстве.

Рисунок 1 – Fucus vesiculosus

Цель данного исследования – определение целесообразности использования бурых водорослей в качестве сырья для извлечения каротиноидов, обладающих антиоксидантной активностью.

В процессе работы будут рассмотрены различные факторы экстракции, включая температуру, гидромодуль и продолжительность экстракции, что позволит выявить наиболее эффективные подходы для извлечения каротиноидов. Оценка антиоксидантной активности экстракта позволит установить его потенциальное применение в пищевой и фармацевтической промышленности.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись бурые водоросли Fucus vesiculosus , собранные в Балтийском море в осенний сезон. Перед экстракцией водоросли были высушены и измельчены.

Каротиноиды извлекали путем экстрагирования материала этиловым спиртом, так как в ходе экстракции этанолом извлекается основная часть минеральных и органических веществ, обладающих биологической активностью. Низкая токсичность этанола определяет его использование в пищевой промышленности в качестве растворителя.

Для определения оптимальных условий экстракции каротиноидов из бурых водорослей, а также целесообразности использования бурых водорослей в качестве источника каротиноидов был проведен полнофакторный эксперимент. Для определения параметров экстракции была использована матрица экспериментов, составленная в соответствии с принципами систематического подхода к моделированию процессов. План факторного эксперимента был разработан в соответствии с дизайном Бокса - Бенкена (ориг. Box - Behnken design, или BBD), который позволяет построить регрессионную модель при меньшем количестве экспериментальных серий, нежели CCD (Central composite design), или полный факторный эксперимент, за счет отсутствия точек, в которых сразу несколько факторов принимают экстремальные значения. При оптимизации использовали метод отклика поверхности для исследования взаимосвязей между входными факторами и откликом на основе данных, полученных в ходе эксперимента [14].

Для описания процесса была выбрана полиномиальная модель второго порядка (формула 1).

^ = ^ o + S 3=i Д^ + ² 3=1 A i ^ 2 +2 2=1 2 3=1+1 ^Aij % ij ,           (1)

где A 0 , A i , A ii и A ij – коэффициенты регрессии; Y – значение зависимой переменной; X i , X j – независимые переменные. Уравнение отражает линейное, квадратичное и перекрестное влияние независимых факторов на отклик.

В качестве входных факторов были выбраны следующие параметры: температура – от 2 до 50 °C, гидромодуль - от 1:20 до 1:5, длительность экстракции - в диапазоне от 120 до 360 мин. Для удобства каждому фактору был присвоен буквенный код (A – температура, °C, B – гидромодуль, C – продолжительность экстракции, мин). Уровни независимых переменных с их значениями приведены в таблице 1.

Таблица 1

Уровни независимых переменных для экстракции каротиноидов

Фактор		Уровень
		-1	0	+1
A	Температура, °C	2	26	50
B	Гидромодуль	1:20	1:10	1:5
C	Продолжительность экстракции, ч	120	240	360

Откликом являлось количество каротиноидов, которое рассчитывали по формуле (2) [15]:

_{с =} 1000*D 470 —2,13*C ch(a) —97,63* C ch(b)                                  (2)

c                      209                 , где Cc – количественное содержание каротиноидов (мг/л); D470 – оптическая плотность в области максимума поглощения каротиноидов; Cch(a), Cch(b) - содержание хлофиллов а и b в экстракте.

Планирование, статистическая обработка данных и оптимизация эксперимента проводились в программе Minitab 21.1.1 (Minitab, Inc., США).

Для определения антиоксидантной активности каротиноидов в экстракте использовали метод DPPH, основанный на взаимодействии радикалов со стабильным хромоген-радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) [16]. Раствор DPPH готовили по стандартной методике: в мерной колбе взвешивали реактив массой 0,004 г и разбавляли его 100 мл этилового спирта. Кинетику снижения оптической плотности раствора до и после добавления DPPH регистрировали в течение 30 мин при длине волны 517 нм [17].

Антирадикальную активность определяли по формуле 3.

% ингибирования = А0^Ах х 100 %,

где А х – оптическая плотность исследуемого раствора; А 0 – оптическая плотность экстракта.

Результаты эксперимента

Для экстракции каротиноидов в качестве растворителя был использован этиловый спирт (96 %), количественные параметры изменялись в следующем порядке: температура (20, 35, 50 ° С), гидромодуль (1:20, 1:10, 1:5) и время экстракции (120, 240, 360 мин).

Полученные данные для дизайна каждого эксперимента приведены в таблице 2. Все измерения проведены в трех повторностях.

При статистическом анализе была определена значимость параметров. На диаграмме Парето стандартизированных эффектов (рис. 2) все параметры имели значение ниже 2,228 – концентрации каротиноидов (мг/л) при критерии значимости p = 0,05. Это позволило сделать вывод, что при данной модели независимые параметры не оказывали влияние на статистическую модель.

Дизайн эксперимента

Таблица 2

Номер эксперимента	Температура, °C	Гидромодуль	Продолжительность экстракции, мин	Содержание каротиноидов, мг/л
1	35	1:20	240	не обнаружено
2	50	1:20	120	не обнаружено
3	50	1:5	120	0,45 ± 0,02
4	20	1:5	360	0,71 ± 0,02
5	35	1:10	240	0,01 ± 0,02
6	35	1:10	120	0,02 ± 0,02
7	35	1:10	240	0,09 ± 0,02
8	20	1:10	240	0,37 ± 0,02
9	20	1:20	360	не обнаружено
10	35	1:10	240	0,04 ± 0,02
11	35	1:5	240	0,63 ± 0,02
12	50	1:20	360	0,11 ± 0,02
13	20	1:20	120	не обнаружено
14	35	1:10	360	0,04 ± 0,02
15	20	1:5	120	0,14 ± 0,02
16	35	1:10	240	0,03 ± 0,02
17	35	1:10	240	0,49 ± 0,02
18	35	1:10	240	не обнаружено
19	50	1:5	360	не обнаружено
20	50	1:10	240	0,22 ± 0,02

Факторы и их взаимодействия

Факторы:

А - температура, ° С;

В - гидромодуль (соотношение массы сырья к экстрагенту;

С - длительность экстракции, ч

Стандартизированные эффекты

Рисунок 2 – Диаграмма Парето стандартизированных эффектов (отклик – содержание каротиноидов, мг/л)

Также была определена регрессионная модель, в которой коэффициент детерминации равен 0,5835. Это означало, что примерно 58 % вариации зависимой переменной можно было объяснить независимыми переменными в модели. Подобный коэффициент детерминации являлся удовлетворительным при статистической обработке модели, модель являлась статистически значимой, но нуждалась в доработке или изменении параметров.

Статистически значимыми параметрами оказались гидромодуль и температура. Длительность экстракции оказывала незначительное влияние.

С помощью дисперсионного анализа была выполнена оценка статистической значимости каждого из регрессионных коэффициентов, включая линейные, квадратичные и эффекты взаимодействий. Для эксперимента было определено уравнение регрессии (4).

У = -2,47 + 0,0192 х Л + 14,8 х В + 0,000428 х Л2 — 7,8 х В2 - 0,196 х АВ,

где A – температура, °C; B – гидромодуль.

Графики поверхности также иллюстрируют характер зависимости отклика от входных факторов (рис. 3).

Рисунок 3 – Графики поверхности отклика и контурные графики для экстракции каротиноидов: а – зависимость содержания каротиноидов (мг/л) при взаимном влиянии гидромодуля и температуры; б – зависимость содержания каротиноидов (мг/л) при взаимном влиянии продолжительности экстракции и температуры; в – зависимость содержания каротиноидов (мг/л) при взаимном влиянии продолжительности экстракции и гидромодуля

На рисунке 3а форма поверхности соответствовала взаимному влиянию переменных температуры и гидромодуля, при этом максимум функции отмечался при максимальном уровне гидромодуля и минимальной температуре. На рисунке 3б форма поверхности соответствовала взаимному влиянию переменных температуры и продолжительности экстракции, при этом максимум функции отмечался при максимальной длительности экстракции. На рисунке 3в форма поверхности соответствовала взаимному влиянию переменных гидромодуля и продолжительности экстракции, при этом максимум функции отмечался при максимальном значении гидромодуля.

В ходе эксперимента было установлено, что максимальное извлечение каротиноидов наблюдалось при гидромодуле 1:5 и температуре экстракции 20 ° С. При этом статистическая модель нуждалась в доработке, поэтому в рамках дальнейших исследований планируется рассмотреть в качестве экстрагентов хлороформ и ацетон, при использовании которых потребуется дальнейшая очистка полученных каротиноидов, так как эти экстрагенты небезопасны при использовании в пищевом производстве.

Антиоксидантная активность каротиноидов была определена в экстракте с наибольшим выходом каротиноидов (гидромодуль 1:5, температура экстракции 20 ° С, растворитель - этиловый спирт (96 %)) по формуле (3). Антиоксидантная активность выбранного экстракта составила 75 %, следовательно, каротиноиды, экстрагированные из исследуемых водорослей, обладали высокой способностью защиты клеток от действия свободных радикалов.

Заключение

Наибольший выход каротиноидов наблюдался в экстракте, полученном при температуре 20 ° С и гидромодуле 1:5. Данный экстракт показал хороший результат ингибирования свободных радикалов – 75 %, что позволило сделать вывод о высокой антиоксидантной активности экстрактов бурых водорослей и перспективности их использования в качестве сырья для получения биологически активных добавок.

С учетом растущего интереса к натуральным продуктам и здоровому образу жизни фукус может стать ценным источником биоактивных соединений, что откроет новые возможности для его применения в различных отраслях, включая пищевую, косметическую и фармацевтическую. Дальнейшие исследования и разработки технологий экстракции помогут максимально эффективно использовать этот ресурс и раскрыть его потенциал для здоровья человека.

В рамках дальнейших исследований планируется расширить спектр биологически активных веществ, выделенных из бурых водорослей, для получения биологически активных добавок (полифенольные, йодсодержащие соединения, полисахариды) с терапевтическими и антиоксидантными свойствами.

Работа выполнена при поддержке научного проекта НИРМА Университета ИТМО № 623096 «Научно-практические аспекты переработки возобновляемых источников сырья для получения биотоплива и продуктов с высокой добавленной стоимостью» (руководитель: О.В. Кригер).