Поиск информативных SSR-маркеров для паспортизации сортов сои

Введение. По данным SoyStats [1], около 60 % мирового производства масличных культур приходится на сою. Это связано с ее уникальным биохимическим составом, благодаря которому культура получила широкие возможности использования. Увеличение производства сои наблюдается и в Российской Федерации [2]. Этому способствует создание новых высокоурожайных сортов, устойчивых к различным биотическим и абиотическим факторам.

В последние годы в селекции сельскохозяйственных культур эффективно применяют методы молекулярно-генетического анализа. Их используют при оценке селекционного материала, паспортизации и идентификации генотипов. В связи с изменениями в законе «О семеноводстве» [3] генетическая паспортизация станет обязательной для сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, включенных в утвержденный перечень, в том числе и для сои. Общепринятая методика генетической паспортизации отсутствует. Поэтому необходимы исследо- вания по разработке таких методик, специфичных для каждой культуры.

Эффективность использования микро-сателлитных (SSR) маркеров для генотипирования сои и других культур была показана разными исследованиями [4; 5; 6; 7; 8]. Данный тип маркеров имеет высокий уровень полиморфизма, кодоминантный тип наследования, высокую воспроизводимость результатов анализа, относительную простоту детекции. Это делает их пригодными для многих задач: составления генетических карт, изучения генетического разнообразия, идентификации и паспортизации сортов и гибридов сельскохозяйственных культур [9].

Ранее нами были отобраны микроса-теллитные локусы, которые используются в настоящее время в качестве ДНК-маркеров для генетической идентификации новых сортов сои селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Наши исследования показали высокий уровень информативности применяемых SSR-локусов, однако этого оказалось недостаточно для различия некоторых сортов [10; 11]. Поэтому целью настоящего исследования стал поиск информативных SSR-локусов для дополнения существующей системы ДНК-маркеров для паспортизации сортов сои.

Материалы и методы. Для исследования были выбраны 20 сортов сои разного происхождения, полученные с Армавирской опытной станции и центральной экспериментальной базы ФГБ-НУ ФНЦ ВНИИМК (T-25, Ходсон, Витязь 50, Сибириада, Локус, Кубанская 4958, Кубань, Уника, ВНИИМК 3895, ВНИИМК 9186, Элана, Дельта, Дока, Зара, Весточка, Пума, Саяна, Триада), а также из коллекции генетических ресурсов растений ВИР (Williams 82, Lee). ДНК выделяли из смеси осевых органов зародышей 10 семян каждого сорта набором реагентов DiamondDNA Plant (ООО АВТ, РФ) согласно прилагаемой инструкции. Оценку качества и количества выделенной ДНК проводили с помощью микроспектрофотометра Nano-300 (Allsheng, КНР).

Поиск микросателлитных локусов и фланкирующих последовательностей осуществляли в базе данных SoyBase [12]. Проверку специфичности отжига праймеров, температур их плавления и размера ожидаемого фрагмента проводили in silico с помощью онлайн инструмента Primer-BLAST [13; 14].

Для подбора оптимальной температуры отжига праймеров с каждой парой проводили экспериментальные ПЦР в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, 1,5–3,0 мМ MgCl 2 (НПО «СибЭнзим», РФ), 200 мкМ каждого dNTP («Евроген», РФ), 0,5 мкМ каждого праймера, 0,1 мкл SynTaq ДНК полимеразы (ООО «Синтол», РФ), 40– 50 нг геномной ДНК и деионизированную воду. Амплификацию осуществляли при следующих температурно-временных режимах: начальная денатурация при 96 °С в течение 2 мин; затем 35 циклов: денатурация при 94 °С – 30 сек, отжиг при 50– 65 °С – 40 сек, элонгация при 70 °С – 1 мин, финальная элонгация при 70 °С – 2 мин в термоциклере MiniAmp Plus (Thermo Fisher, США) в независимых температурных блоках (Veriflex) с изменением температуры отжига на 2–3 °С. ПЦР-продукты разделяли в 2%-ом агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в камере горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, РФ) при силе тока 90 mA и напряжении 180 V в течение 30 мин. Визуализация результатов электрофореза обеспечивалась с помощью гель-документирующей системы GenoSens Touch 2200 (Clinx Science Instruments, КНР) в УФ-лучах.

Далее ПЦР с каждой парой праймеров проводили по вышеописанному протоколу при подобранной оптимальной температуре отжига. Полученные ПЦР-продукты разделяли в 8%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях в камере для вертикального электрофореза VE-20 (Хеликон, РФ) при параметрах силы тока и напряжения – 200 mA, 800 V, предварительно денатурируя пробы. Гели окрашивали нитратом серебра и документировали на приборе GenoSens Touch 2200 на экране белого света.

Информативность микросателлитных локусов оценивали по следующим показателям: наблюдаемое (n a ) и эффективное число аллелей (n e ), индекс полиморфного информационного содержания (PIC).

Результаты и обсуждение. Для идентификации сортов сои в дополнение к ранее изученным микросателлитам из базы данных SoyBase отбирали локусы, содержащие три- и тетрануклеотидные микро-сателлитные повторы. Динуклеотидные микросателлитные локусы в исследование не включали, поскольку при их амплификации чаще образуются дополнительные ПЦР-продукты, отличающиеся на 1–2 повтора (статтеры), которые затрудняют интерпретацию результатов фрагментного анализа.

Последовательности праймеров, фланкирующих локусы, отобранные на первом этапе, проверяли с помощью онлайн инструмента Primer-BLAST на референсном геноме сои Glycine_max_v4.0 (Williams 82). Проверку осуществляли по следующим параметрам: отсутствие неспецифического связывания с ДНК матрицей; низкая вариабельность температуры плавления между праймерами (не более 3 °С); размер ожидаемого ПЦР-продукта (от 100 до 500 п.н.). Маркеры, не отвечающие вышеперечисленным параметрам, исключались из дальнейшего исследования. В результате проведенной работы in silico было отобрано 27 микросателлит-ных локусов (табл. 1).

Следующим этапом работы стала оптимизация температуры отжига праймеров. За основу были взяты данные температур плавления (Tm) из PrimerBLAST, но поскольку значения температуры плавления отличаются от значений температуры отжига (Ta), требуется их экспериментальная оптимизация. Для этого с каждой парой праймеров проводили ПЦР, изменяя в протоколе амплификации температуру отжига на 2–3 °С.

Таблица 1

Характеристика микросателлитных локусов ДНК сои на основе данных сборки генома Glycine_max_v4.0

№	Локус	Хромосома	Мотив	Размер фрагмента, п.н.
1	SАTT631	3	(ATT)16	152
2	SATT549	3	(TAT)21	244
3	SATT257	3	(ATA)10	251
4	SATT713	4	(TTAT)3	254
5	AW277661	4	(TAT)23	250
6	SATT684	5	(ATA)17	188
7	SATT471	5	(TAT)18	241
8	CSSR531	7	(TAA)13	245
9	SATT636	7	(ATT)22	172
10	SATT207	8	(ATA)24	239
11	SATT333	8	(TAT)22	191
12	SATT500	10	(TAA)21	308
13	SATT633	10	(TAA)12	131
14	SATT638	11	(ATA)13	174
15	SATT359	11	(TAT)15	178
16	SATT635	12	(ATA)7	172
17	SATT353	12	(TTA)17	170
18	SATT304	14	(TAA)30	225
19	SATT 168	14	(ATA)17	226
20	SATT651	15	(ATA)10	169
21	SATT263	15	(TTA)19	222
22	SATT287	16	(ATA)18	228
23	SAT222	17	(TTCT)3	168
24	SATT311	17	(AAT)13	181
25	SATT398	19	(ATTA)3	184
26	SATT292	20	(ATA)16	236
27	SATT614	20	(TTA)38	309

Выбор оптимального значения температуры отжига основывался на полученных спектрах ДНК в результате электрофоретического разделения ПЦР-продуктов в агарозном геле. Оптимальной считалась температура отжига, при которой были получены четкие профили ДНК, находящиеся в характерном для каждого локуса диапазоне размера фрагментов, неспецифичные фрагменты отсутствовали. Полученные значения температуры отжига в сравнении с расчетной температурой плавления представлены в таблице 2.

Таблица 2

Оптимизация температуры отжига праймеров микросателлитных локусов ДНК сои

№	Локус	T m , °С	T a , °С
1	Sаtt631	62,0	58,0
2	Satt549	62,0	60,0
3	Satt257	59,0	60,0
4	Satt713	60,0	60,0
5	AW277661	59,5	64,0
6	Satt684	57,0	60,0
7	Satt471	59,5	60,0
8	CSSR531	54,0	60,0
9	Satt636	59,0	60,0
10	Satt207	58,5	58,0
11	Satt333	61,5	64,0
12	Satt500	59,0	60,0
13	Satt633	60,5	64,0
14	Satt638	61,0	60,0
15	Satt359	57,5	58,0
16	Satt635	58,5	58,0
17	Satt353	61,5	64,0
18	Satt304	58,5	60,0
19	Satt168	55,5	58,0
20	Satt651	61,0	60,0
21	Satt263	55,5	60,0
22	Satt287	59,5	60,0
23	Sat222	63,0	64,0
24	Satt311	59,5	60,0
25	Satt398	62,5	60,0
26	Satt292	59,0	60,0
27	Satt614	58,5	60,0

T m – температура плавления праймеров из PrimerBLAST;

T a – температура отжига праймеров экспериментально подобранная

Как видно из таблицы 2, значения температуры отжига отличались от расчетных температур плавления у всех праймеров. Температура отжига праймеров разных локусов варьировала от 58 до 64 °С. Для создания технологии генотипирования сортов сои на основе SSR-маркеров необходимо учитывать, что при проведении мультиплексной ПЦР праймеры должны гибридизоваться при одинаковой температуре. Соответственно, праймеры из разных температурных групп не могут входить в состав мультиплексной реакции, поскольку это снизит их специфичность или вовсе исключит амплификацию.

Информативность изучаемых локусов определяли на 20 сортах сои разного происхождения. Продукты ПЦР разделяли в ПААГ в денатурирующих условиях. По полученным электрофореграммам уста- навливали наличие/отсутствие специфичных и неспецифичных фракций, полиморфизм выявленных фрагментов ДНК (аллелей). В ходе исследования локусы Satt311 и Satt398 были исключены, поскольку результаты амплификации с ними были нестабильны. При анализе локуса Sаtt631 были выявлены неспецифичные фракции, а локусов Satt257 и Satt713 – нулевые аллели, поэтому данные локусы также были исключены из дальнейшего исследования.

Для оценки уровня информативности микросателлитных локусов рассчитывали эффективное число аллелей (n e ) и индекс полиморфного информационного содержания (PIC). Результаты расчетов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Основные показатели информативности микросателлитных локусов ДНК сои

№ Локус na ne PIC 1 Sаtt631 - - - 2 Satt549 3 2,38 0,49 3 Satt257 - - - 4 Satt713 - - - 5 AW277661 4 2,63 0,54 6 Satt684 4 2,78 0,58 7 Satt471 2 1,72 0,33 8 CSSR531 4 2,40 0,56 9 Satt636 4 2,45 0,50 10 Satt207 4 2,86 0,56 11 Satt333 4 2,17 0,49 12 Satt500 3 2,33 0,48 13 Satt633 2 2,00 0,38 14 Satt638 2 1,35 0,22 15 Satt359 3 2,17 0,47 16 Satt635 4 3,23 0,63 17 Satt353 3 2,22 0,44 18 Satt304 2 1,47 0,27 19 Satt168 5 4,00 0,71 20 Satt651 4 2,90 0,66 21 Satt263 3 2,78 0,56 22 Satt287 4 2,50 0,55 23 Sat222 3 2,50 0,53 24 Satt311 - - - 25 Satt398 - - - 26 Satt292 4 4,00 0,70 27 Satt614 5 4,17 0,72 na – наблюдаемое число аллелей;

n e – эффективное число аллелей;

PIC – индекс полиморфного информационного содержания

По анализируемым локусам было выявлено от 2 до 5 аллелей. При этом эффективное число аллелей варьировало от 1,35 (Satt638) до 4,17 (Satt614), а индекс полиморфного информационного содержания – от 0,22 до 0,72 у этих же локусов. Для идентификации сортов и гибридов сельскохозяйственных культур предпочтительнее использовать маркеры, выявляющие три и более аллельных варианта. Поэтому локусы Satt471, Satt633, Satt638 и Satt304 были исключены (n a = 2). К высокоинформативным (PIC > 0,5) в нашем исследовании можно отнести большинство микросателлитных локусов: Satt614, Satt168, Satt292, Satt651, Satt635, Satt684, CSSR531, Satt207, Satt263, Satt287, AW277661, Sat222, Satt636. Поскольку паспортизацию планируется проводить с помощью метода капиллярного электрофореза, разрешающая способность и точность которого выше применяемого в настоящем исследовании метода, оценка информативности является предварительной. Поэтому локусы, обладающие меньшим уровнем полиморфизма (со значением PIC от 0,44 до 0,49), не исключаются из дальнейшего исследования и также могут быть использованы для паспортизации сортов сои.

Заключение. В результате исследования in silico было отобрано 27 микроса-теллитных локусов, отвечающих заданным параметрам. Экспериментально подобрана температура отжига праймеров для проведения ПЦР с ними. По данным нашего исследования 13 SSR-локусов оказались высокоинформативными (PIC > 0,5), еще пять обладали меньшим уровнем полиморфизма, но также были информативны (PIC 0,44–0,49). Отобранные в результате настоящего исследования микросателлитные локусы могут быть использованы для генотипирования и, совместно с апробированными нами ранее ДНК-маркерами, для паспортизации сортов сои.