Полиморфизм гена NFAT5 как фактор риска развития остеоартроза коленного сустава

Новаков Виталий Борисович – аспирант медицинского института, травматолог-ортопед (e-mail: ; тел.: 8 (472) 255-85-70; ORCID: .

Новакова Ольга Николаевна – кандидат биологических наук, доцент (e-mail: ; тел.: 8 (472) 230-13-83; ORCID: .

Чурносов Михаил Иванович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой медико-биологических дисциплин (e-mail: ; тел.: 8 (472) 230-13-83; ORCID: .

ет трудоспособное население, приводит к преждевременной инвалидизации [15].

Остеоартроз, как и ряд других заболеваний человека, считается многофакторным, возникающим в результате взаимодействия ряда средовых, эпигенетических и генетических факторов риска [16]. Согласно литературным данным, доля генетической компоненты при развитии ОА может варьироваться от 40 до 65 % [17, 18]. Генетические основы ОА посредством полногеномного поиска ассоциаций активно изучаются различными научными коллективами. Согласно данным каталога GWAS, за период с 2008 г. по настоящее время выполнено 24 полногеномных исследования ОА коленного, тазобедренного суставов и суставов руки¹, в результате которых выявлено более 250 GWAS-значимых однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), ассоциированных с развитием ОА. Стоит отметить, что 13 из 24 исследований посвящены изучению роли генетических факторов в развитии ОА коленного сустава, в результате установлено более 80 полиморфных локусов, ассоциированных с риском развития ОА коленного сустава ( p ≤ 5·10^–08). Подавляющее большинство этих GWAS-значимых для ОА коленного сустава локусов (более 95 %) выявлено на выборках исследуемых европеоидного происхождения. Но следует также отметить, что в эти полногеномные исследования выборки из Российской Федерации не были включены.

Наряду с полногеномными исследованиями ОА особое значение имеет проведение репликативных исследований, которые позволяют установить роль конкретных GWAS-значимых для ОА полиморфных маркеров в формировании заболевания в отдельных популяциях мира, в том числе и в популяциях России. Согласно имеющимся литературным данным, к настоящему времени в различных популяциях мира проведено ограниченное количество репликативных исследований ОА коленного сустава и ОА других локализаций [19–26]. В результате этих репликативных исследований лишь для единичных GWAS-значимых полиморфных локусов подтверждены ассоциации с данным заболеванием: в целом ОА – 4 SNPs (rs2302061, rs7639618, rs4836732, rs3204689), ОА коленного сустава – 7 SNPs (rs4867568, rs143383, rs3884606, rs10947262, rs7639618, rs6976, rs2302061). При этом три из семи SNPs (rs4867568, rs143383, rs3884606) подтвердили связь с ОА коленного сустава в азиатских популяциях и четыре SNPs (rs10947262, rs7639618, rs6976, rs2302061) – в европейских популяциях или смешанных выборках европейцев и азиатов.

Важно подчеркнуть, что в отечественной литературе представлены результаты лишь одного репликативного исследования ОА у женского населения Башкортостана [26]. Авторы провели анализ ассоциаций девяти GWAS-значимых полиморфных вариантов rs4836732 гена ASTN2 , rs1298744 и rs2302061

гена DOT1L , rs3204689 гена ALDH1A2 , rs6976 гена GLT8D1 , rs11177 гена GNL3 , rs6094710 гена NCOA3 , rs11841874 гена MCF2L , rs7639618 гена DVWA с ОА на выборке из 256 больных и 161 человека, вошедшего в контрольную грппу. В результате этого исследования только для пяти SNP (rs2302061 DOT1L , rs7639618 DVWA , rs4836732 ASTN2 , rs6976 GLT8D1 , rs3204689 ALDH1A2 ) были подтверждены ассоциации с ОА различных локализаций, в том числе с ОА коленного сустава показали связь только три SNP – rs2302061 DOT1L , rs7639618 DVWA , rs6976 GLT8D1 .

Таким образом, к настоящему моменту времени среди известных более 80 GWAS-значимых для ОА коленного сустава полиморфных локусов связь с заболеванием для европейского населения подтверждена в репликативных исследованиях лишь для четырех локусов – rs10947262 гена BTNL2, rs7639618 гена COL6A4P1, rs2302061 гена DOT1L , rs6976 гена GLT8D1 , что крайне недостаточно. Следует отметить, что для десяти SNP, изученных в этих репликативных исследованиях в европейских популяциях (или смешанных выборках), ассоциации с ОА коленного сустава не были подтверждены. Вышеизложенные факты диктуют необходимость проведения дальнейших репликативных исследований ОА коленного сустава в различных популяциях, в том числе российских.

Цель исследования – изучить ассоциации полиморфных вариантов rs1060105, rs56116847 гена SBNO1 , rs6499244 гена NFAT5 и rs34195470 гена WWP2 с развитием ОА коленного сустава IV стадии у населения Центрального Черноземья России.

Материалы и методы. Для проведения исследования были сформированы выборки из 95 больных ОА коленного сустава (средний возраст – 52,69 ± 5,67 г.) и 500 индивидуумов контрольной группы (средний возраст – 52,96 ± 6,72 г.). У всех больных была диагностирована IV рентгенологическая стадия заболевания, которая характеризуется наиболее выраженным процессом разрушения различных тканей сустава, прежде всего хрящевой и костной [2]. Клиническое, клиникоинструментальное обследование больных, верификация диагноза проводились сертифицированными врачами травматологического отделения № 1 ОГБУЗ «Городская больница № 2» г. Белгорода. Критериями включения в исследуемую группу больных были: а) первичный ОА коленного сустава, установленный в соответствии с клинико-рентгенологическими критериями Американской ассоциации ревматологов [27]; б) IV рентгенологическая стадия ОА коленного сустава по шкале Келлгрена – Лоуренса [28]; в) наличие боли в коленном суставе (выраженность болевого синдрома при ходьбе по визуально-аналоговой шкале ≥ 40 мм); г) ограничение движения в суставе. В группу контроля включались лица, у которых отсутствовала какая-либо патология опорно-двигательной системы (обследовались при профилактических ос- мотрах). Все участники исследования являлись уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации, имели русскую национальность и не находились в родственных связях друг с другом, предварительно дали согласие на участие в исследовании. Из исследуемых выборок исключались лица с тяжелыми формами артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, сахарного диабета, почечно-печеночной недостаточности, онкологических заболеваний.

Для исследования использовали геномную ДНК, которую выделяли из лейкоцитов методом фенолхлороформной экстракции. Генотипирование образцов ДНК было выполнено с помощью полимеразной цепной реакции c применением TaqMan-зондов.

Отбор полиморфных локусов генов-кандидатов для исследования осуществлен с учетом следующих критериев: 1) наличие ассоциации с ОА коленного сустава в европейских популяциях по результатам ранее проведенных полногеномных исследований (GWAS); 2) выраженное функциональное значение полиморфизма (регуляторный потенциал, связь с экспрессией, альтернативным сплайсингом генов) [29, 30]; 3) частота полиморфизма не менее 5 %. В соответствии с этими критериями для настоящего исследования были отобраны четыре SNPs трех генов: rs1060105, rs56116847 гена SBNO1 , rs6499244 гена NFAT5 и rs34195470 гена WWP2.

Для изучаемых выборок были получены данные об эмпирическом распределении генотипов и его соответствии теоретически ожидаемому согласно закономерности Харди – Вайнберга (отклонения принимались за статистически значимые при p ≤ 0,05). При сравнении частот аллелей и генотипов между группой больных ОА и контрольной применяли критерий χ² с поправкой Йетса на непрерывность, использовали таблицы сопряженности 2×2, силу ассоциации оценивали показателем отношении шансов ( OR ) с 95%-ным доверительным интервалом (95 % CI ) в программе Statistica for Windows 6.0. Ассоциации изучаемых полиморфных локусов генов-кандидатов c ОА оценивали при помощи логистической линейной регрессии (рассматривались четыре генетические модели: аллельная, аддитивная, рецессивная и доминантная) с учетом ковариат – возраст, ИМТ. Все вычисления выполнялись в программе gPLINK [31]. Проводилась коррекция на множественные сравнения с учетом пермутационного теста (за статистически значимый принимали p perm < 0,05) [32].

Оценку функциональных эффектов полиморфизма генов-кандидатов, показавших значимые ассоциации с ОА, проводили с использованием онлайн-ресурсов HaploReg (v4.1)2 – изучался регуляторный потенциал [29, 33], GTExPortal3 – исследовались влияние на экспрессию генов и альтернативный сплайсинг [30].

Результаты и их обсуждение. Выявлено, что для всех рассматриваемых полиморфных локусов генов-кандидатов в группе больных и контрольной наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому согласно равновесию Харди – Вайнберга (p > 0,05) (табл. 1).

Анализ ассоциаций аллелей и генотипов изученного полиморфизма кандидатных генов с развитием ОА коленного сустава IV стадии позволил установить связь локуса rs6499244 гена NFAT5 с заболеванием (см. табл. 1). С помощью логистического регрессионного анализа выявлено, что минорный аллель A rs6499244 гена NFAT5 имеет «рисковое» значение для ОА в рамках аддитивной ( OR = 1,61; 95 % CI = 1,09–2,38; p = 0,02; р perm = 0,02) и рецессивной ( OR = 2,07; 95 % CI = 1,10–3,90; p = 0,02; р perm = 0,02) генетических моделей.

Таким образом, в рамках данной работы выявлен генетический фактор риска развития ОА коленного сустава IV стадии – аллель A rs6499244 гена NFAT5 .

На следующем этапе работы проведен анализ регуляторных эффектов rs6499244 гена NFAT5 (с помощью современных биоинформатических ресурсов), который показал важное функциональное значение данного локуса в организме.

Используя онлайн-ресурс HaploReg (v4.1)², установлено, что rs6499244 расположен в 3'-нетранс-лируемой области гена NFAT5 , находится в эволюционно консервативном регионе, в области гиперчувствительности к ДНКазе-1 в тканях яичника, в регионе регуляторных мотивов к четырем факторам транскрипции (CDP_6, RFX5_known1, RORalpha1_2, TCF4_known1). Выявлена локализация rs6499244 гена NFAT5 в области ДНК, связанной с гистоновыми белками (H3K27ac), маркирующими активные энхансеры в культуре клеток хондроцитов, мозга, жировой ткани, в клетках периферической крови, а также в ДНК-регионе, взаимодействующем с белками-гистонами типа H3K9ac, маркирующими функционально активные промо-торные участки в клетках жировой ткани, первичных мононуклеарах периферической крови. При этом аллель А, имеющий «рисковое» значение в развитии ОА, повышает аффинность к четырем факторам транскрипции: CDP_6 (ΔLOD = 3,3), RFX5_known1 (ΔLOD = 10,9), RORalpha1_2 (ΔLOD = 12), TCF4_known1 (ΔLOD = 5).

С помощью онлайн-ресурса GTExPortal³ установлено, что локус rs6499244 значимо ассоциирован с уровнем экспрессии девяти генов ( CLEC18A, COG4, EXOSC6, NFAT5, NOB1, NPIPB14P, NQO1, PDXDC2P, SMG1P7 ) и альтернативным сплайсингом мРНК трех генов ( NOB1, NPIPB14P, NQO1 ) в патогенетически значимых для ОА культурах клетках, тканях и органах (жировая ткань, скелетные мышцы, большеберцовые артерии и нервы) (табл. 2). Выявлено, что rs6499244 связан с уровнем экспрессии генов CLEC18A, EXOSC6, NPIPB14P, SMG1P7 и альтернативным сплайсингом

Таблица 1

Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов-кандидатов у больных остеоартрозом коленного сустава IV стадии и в контрольной группе

Полиморфизм	Аллели, генотипы	Больные ОА IV стадии ( n = 95), абс. (%)	Контрольная группа ( n = 500), абс. (%)	OR (95 % CI )	p
о	С	149 (78,42)	788 (78,80)	0,98 (0,66–1,95)	0,98
	T	41 (21,58)	212 (21,20)	1,02 (0,69–1,52)
	C/C	58 (61,05)	315 (63,00)	0,92 (0,57–1,48)	0,81
	C/T	33 (34,74)	158 (31,60)	1,15 (0,71–1,87)	0,63
	T/T	4 (4,21)	27 (5,40)	0,77 (0,22–2,39)	0,82
	H o /H e (P HWE )	0,347/0,338 (1,000)	0,316/0,334 (0,229)
	Минорный аллель T (модель аллельная)			1,02 (0,70–1,49)	0,91
	C/C vs. C/T vs. T/T (модель аддитивная)			1,24 (0,77–1,98)	0,38
	C/C vs. C/T + T/T (модель доминантная)			1,37 (0,78–2,42)	0,28
	C/C + C/T vs. T/T (модель рецессивная)			0,95 (0,25–3,65)	0,94
ОО 40 40 в	G	119 (62,63)	640 (64,26)	0,93 (0,67–1,30)	0,73
	A	71 (37,37)	356 (35,74)	1,07 (0,77–1,50)
	G/G	37 (38,95)	213 (42,77)	0,85 (0,53–1,37)	0,56
	A/G	45 (47,37)	214 (42,97)	1,19 (0,75–1,90)	0,50
	A/A	13 (13,68)	71 (14,26)	0,95 (0,48–1,87)	1,00
	H o /H e (P HWE )	0,474/0,468 (1,000)	0,430/0,459 (0,145)
	Минорный аллель A (модель аллельная)			1,07 (0,78–1,48)	0,67
	G/G vs. A/G vs. A/A (модель аддитивная)			0,84 (0,56–1,28)	0,42
	G/G vs. A/G + A/A (модель доминантная)			0,82 (0,47–1,45)	0,50
	G/G + A/G vs. A/A (модель рецессивная)			0,76 (0,33–1,77)	0,53
СЧ 04 04 40	T	94 (49,47)	543 (54,30)	0,82 (0,60–1,14)	0,25
	A	96 (50,53)	457 (45,70)	1,21 (0,88–1,68)
	T/T	26 (27,37)	157(31,40)	0,82 (0,49–1,38)	0,51
	A/T	42 (44,21)	229 (45,80)	0,94 (0,59–1,49)	0,86
	A/A	27 (28,42)	114 (22,80)	1,34 (0,80–2,26)	0,29
	H o /H e (P HWE )	0,442/0,500 (0,304)	0,458/0,496 (0,087)
	Минорный аллель A (модель аллельная)			1,21 (0,89–1,66)	0,22
	T/T vs. A/T vs. A/A (модель аддитивная)			1,61 (1,09–2,38)	0,02
	T/T vs. A/T + A/A (модель доминантная)			1,74 (0,91–3,32)	0,09
	T/T + A/T vs. A/A (модель рецессивная)			2,07 (1,10–3,90)	0,02
04	G	101 (53,72)	523 (52,40)	1,05 (0,76–1,46)	0,80
	A	87 (46,28)	475 (47,60)	0,95 (0,67–1,31)
	G/G	24 (25,53)	136 (27,25)	0,92 (0,54–1,56)	0,83
	A/G	53 (56,38)	251 (50,30)	1,28 (0,80–2,04)	0,33
	A/A	17 (18,09)	112 (22,45)	0,76 (0,42–1,39)	0,42
	H o /H e (P HWE )	0,564/0,497 (0,222)	0,503/0,499 (0,929)
	Минорный аллель A (модель аллельная)			0,95 (0,69–1,30)	0,74
	G/G vs. A/G vs. A/A (модель аддитивная)			0,97 (0,64–1,47)	0,89
	G/G vs. A/G + A/A (модель доминантная)			1,05 (0,55–2,01)	0,88
	G/G + A/G vs. A/A (модель рецессивная)			0,87 (0,42–1,77)	0,69

П р и м е ч а н и е : OR – отношение шансов, 95 % СI – 95%-ный доверительный интервал отношения шансов, p – уровень значимости, H _o /H _e – наблюдаемая / ожидаемая гетерозиготность, P_HWE – уровень значимости отклонения от закона Харди – Вайнберга.

Таблица 2

Материалы по ассоциациям rs6499244 гена NFAT5 с уровнем экспрессии (eQTL) и альтернативным сплайсингом мРНК (sQTL) генов в патогенетически значимых для ОА клетках, тканях и органах мРНК трех генов NOB1, NPIPB14P, NQO1 в жировой ткани. Известно, что жировая ткань вырабатывает адипокины, которые не только участвуют в обменных процессах, но и способствуют хроническим воспалительным реакциям в организме. Адипокины и ряд других цитокинов, действуя совместно, в итоге приводят к процессам деградации хрящевой ткани [34]. В исследовании T.N. Boer et al. (2012) было показано, что уровни адипокинов у больных ОА с четвертой рентгенологической стадией были значительно выше, чем в контрольной группе (p < 0,001) [35].

Стоит отметить, что NFAT5 также участвует в регуляции воспалительных реакций в организме за счет активации иммунных клеток, особенно Т-клеток и макрофагов [36].

Выявлено, что аллельный вариант А rs6499244 гена NFAT5 ассоциирован с низким уровнем экспрессии генов CLEC18A, NOB1, NPIPB14P и альтернативным сплайсингом мРНК гена NOB1 в скелетных мышцах (см. табл. 2). Известно, что состояние мышечной ткани, в том числе и слабость мышц, вносит существенный вклад в развитие и прогресси-

Ген	Ткань / орган / культура клеток	Уровень значимости p	Коэффициент линейной регрессии β
eQTL-анализ
CLEC18A	Щитовидная железа	1,9e-9	-0,35
	Жировая ткань	2,4e-7	-0,30
	Скелетные мышцы	0,000057	-0,18
COG4	Культура клеток фибробластов	0,000041	-0,10
EXOSC6	Жировая ткань	0,0000038	-0,21
	Щитовидная железа	0,00040	-0,14
NFAT5	Щитовидная железа	9,1e-19	0,18
	Культура клеток фибробластов	0,0000012	0,083
NOB1	Скелетные мышцы	3,9e-10	-0,11
	Щитовидная железа	3,3e-7	-0,14
	Головной мозг	0,000020	-0,33
NPIPB14P	Большеберцовые нервы	4,7e-15	-0,31
	Культура клеток фибробластов	1,4е-13	-0,28
	Аорта	3,0e-10	-0,27
	Большеберцовая артерия	3,8е-10	-0,21
	Кровь	1,0e-9	-0,17
	Головной мозг	2,0e-9	-0,42
	Скелетные мышцы	6,7e-9	-0,21
	Жировая ткань	7,6e-7	-0,17
NQO1	Головной мозг	0,000061	-0,21
PDXDC2P	Кровь	0,000029	0,11
SMG1P7	Жировая ткань	0,00013	-0,16
sQTL-анализ
NOB1	Скелетные мышцы	3,8e-36	-0,61
	Жировая ткань	8,1e-33	-0,66
	Большеберцовая артерия	2,0e-30	-0,62
	Щитовидная железа	7,9e-30	-0,56
	Культура клеток фибробластов	3,4e-29	-0,68
	Большеберцовые нервы	3,6e-26	-0,63
	Кровь	1,2е-16	0,42
NPIPB14P	Кровь	2,8e-9	-0,34
	Жировая ткань	0,0000032	0,29
	Культура клеток фибробластов	0,0000059	-0,28
NQO1	Культура клеток фибробластов	2,9е-8	0,30
	Жировая ткань	1,6е-7	0,31
	Большеберцовые нервы	0,000023	0,25

П р и м е ч а н и е : eQTL и sQTL – данные GTExPortal [30].

рование ОА [37, 38]. Слабость мышц может быть обусловлена не только отсутствием или низким уровнем физической нагрузки в мышцах, но и происходящими в них воспалительными процессами [38], в регуляции которых может участвовать и NFAT5 [36]. В работе S. Muraki et al. (2015) показано, что слабость четырехглавой мышцы бедра ассоциирована с болью при ОА коленного сустава [37]. В систематическом обзоре и метаанализе B.E. Oiestad et al. (2015) получены данные о том, что слабость мышц коленного сустава связана с повышенным риском развития ОА коленного сустава как у мужчин, так и у женщин [38].

В работе S.J. Rice et al. (2019) представлены данные по ассоциациям локуса rs7359336, который находится в неравновесии по сцеплению с изучаемым нами rs6499244 ( r² = 0,91), с повышенным уровнем метилирования ДНК в гене WWP2 у больных ОА [39]. Авторами также установлено значительное увеличение экспрессии гена CLEC18A в хрящевой ткани у пациентов, перенесших артропластику по поводу ОА ( p = 0,02).

Известно, что ген NFAT5 кодирует фактор транскрипции, который регулирует экспрессию генов, участвующих у млекопитающих в осмотическом стрессе, наличие последнего может стать основой для развития патологических процессов в различных типах гиперосмолярных тканей и органов (почки, эпителий кишечника, эпидермис роговицы глаза и кожи, скелетные мышцы)⁴ [40, 41]. Имеются данные, свидетельствующие о роли NFAT5 в формировании врожденного иммунитета путем активации экспрессии генов в макрофагах при лигировании TLR (Toll-like) рецептора [36, 42, 43]. Стоит отметить, что в патогенезе ОА коленного сустава значимая роль отводится иммунным нарушениям и воспалению синовиальной оболочки – синовиту [2, 44, 45], что впоследствии может приводить к «активизации» матриксных металлопротеиназ [46], обладающих выраженными пролиферативными и провоспали-тельными эффектами. Известно, что TLR2 и TLR4 высокоэкспрессируются в макрофагах синовиальной жидкости и отвечают за активацию макрофагов [47]. NFAT5 также играет важную роль в пролиферации самих синовиоцитов [48]. В воспалительном инфильтрате синовиальной жидкости у пациентов с гонартрозом содержится большое количество мак-

рофагов и T-лимфоцитов [44]. Согласно литературным данным, в инфильтрате преобладают в основном макрофаги – 65 %, Т-лимфоцитов насчитывается до 22 %, В-лимфоцитов – до 5 % [49].

В доступной литературе имеется ограниченное количество исследований, посвященных изучению вовлеченности локуса rs6499244 гена NFAT5 (в нашем исследовании ассоциирован с ОА коленного сустава) в развитие заболеваний человека. В каталоге GWAS представлены результаты только двух полногеномных исследований, показавших значимые ассоциации изучаемого локуса с остеоартрозом коленного сустава [50] и возрастом возникновения менархе [51]. Так, в GWAS исследовании I. Tachmazidou et al. (2019), выполненном на выборках из 77 052 больных ОА различных локализаций, в том числе и ОА коленного сустава, и 378 169 индивидуумов контрольной группы, выявлена ассоциация аллеля А rs6499244 гена NFAT5 с ОА коленного сустава в европейской популяции [50], что полностью согласуется с полученными нами результатами.

Выводы. В результате данного исследования подтверждена ассоциация (реплицирована) GWAS-значимого полиморфного варианта rs6499244 гена NFAT5 с ОА коленного сустава у населения Центрального Черноземья России. Выявлено, что аллель A rs6499244 NFAT5 является фактором риска развития ОА коленного сустав IV стадии ( OR = 1,61–2,07). Полиморфизм rs6499244 гена NFAT5 обладает выраженными функциональными эффектами (находится в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1, повышает аффинность ДНК к четырем факторам транскрипции, локализован в функционально активных промоторах и энхансерах, связан с экспрессией девяти генов ( CLEC18A, COG4, EXOSC6, NFAT5, NOB1, NPIPB14P, NQO1, PDXDC2P, SMG1P7 ) и альтернативным сплайсингом мРНК трех генов ( NOB1, NPIPB14P, NQO1 )) в различных органах и тканях (большеберцовые нервы и артерии, жировая ткань, скелетные мышцы и др.), вовлеченных в патофизиологию заболевания.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.