Полиморфизм гена TP53 (RS1042522) и особенности иммунного профиля у детей, проживающих в условиях аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном

Бенз(а)пирен – полициклический ароматический углеводород I класса опасности, обладает мутагенным, канцерогенным (группа A по классификации МАИР) и иммуносупрессивным свойствами [1, 2].

Воздействие химических техногенных факторов на здоровье населения в условиях реального промышленного центра не является изолированным. Совокупность климатических условий и особенностей светового режима, характерных для той или

Долгих Олег Владимирович – доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Никоношина Наталья Алексеевна – аспирант, младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и аллергологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

иной территории, может модулировать негативные эффекты экспозиции химическими техногенными факторами [3]. В частности, сочетанное воздействие субарктических климатических условий и фотопериодической сезонной асимметрии на северных территориях индуцирует дезадаптационные изменения иммунной регуляции даже на фоне низкоуровневой экспозиции химическими факторами [4, 5].

Важно отметить, что полиморфизм кандидат-ных генов иммунной регуляции вносит весомый вклад в формирование особого иммунного профиля, играющего важную роль в адаптации к измененным условиям окружающей среды [6, 7]. Изменения иммунного профиля, ассоциированные с полиморфными вариантами гена белка-онкосупрессора р53 TP53 (rs1042522), могут быть ассоциированы с нарушениями регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза и повышением риска развития он-копролиферативных состояний, что особо актуально в условиях воздействия бенз(а)пирена как канцерогенного химического фактора [8, 9].

Следовательно, выполнение сравнительной оценки особенностей иммунного профиля, ассоциированных с полиморфными вариантами гена TP53 (rs1042522) у детей в условиях внешнесредового воздействия бенз(а)пирена на севере и юге Восточной Сибири, является особо актуальным для разработки и обоснования системы маркеров эффекта и чувствительности воздействия техногенных химических факторов на северных территориях с особым климатическим фоном и световым режимом.

Цель исследования – выполнить сравнительную оценку полиморфизма гена TP53 (rs1042522) и особенностей иммунного профиля у детей дошкольного возраста в условиях аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном в северной и южной части Восточной Сибири.

Материалы и методы. Осуществлена сравнительная оценка полиморфизма гена TP53 (rs1042522) и показателей иммунного профиля детей дошкольного возраста, проживающих в Восточной Сибири ( n = 1253). Группу наблюдения 1 ( n = 526) и группу наблюдения 2 ( n = 376) составили дети, проживающие в промышленных центрах в северной и южной части региона соответственно. В группу сравнения 1 ( n = 180) и группу сравнения 2 ( n = 171)

включили детей из условно чистых территорий в северной и южной части региона.

Работа выполнена с соблюдением основ Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и одобрена локальным этическим комитетом ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (протокол заседания № 2 от 17.01.2022).

Концентрацию бенз(а)пирена в атмосферном воздухе, а также уровень контаминации крови обследованных детей данным ПАУ определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Agilent 1200 (США) в соответствии с МУК 4.1.3040-121 и МУК 4.1.1273-032.

Определение содержания внутриклеточного транскрипционного фактора р53 проводили посредством проточно-цитометрического анализа на приборе FACSCalibur (США). Уровень продукции IgG к бенз(а)пирену определяли путем тестирования на аллергены методом аллергосорбентного тестирования.

SNP гена транскрипционного фактора р53 TP53 (rs1042522) идентифицировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (PCR-RT) на амплификаторе CFX96 (Сингапур). ДНК выделяли из буккального эпителия сорбентным методом. Генотип каждого человека определяли методом аллельной дискриминации в программе TaqMan.

Статистическая обработка данных выполнена в программе StatSoft Statistica 10.0. с применением методики однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Проверку нормальности распределения данных проводили с использованием одновыборочного критерия Колмогорова – Смирнова. Уровень достоверности различий множественного сравнения проверяли с использованием критерия Тьюки – Крамера. Чтобы отклонить нулевую гипотезу (то есть отсутствие различий), уровень статистической значимости принимали как р < 0,05. Расчет распределения частот генотипов и аллелей гена TP53 (rs1042522), показателя отношения шансов OR , относительного риска RR и их 95%-ных доверительных интервалов ( CI ) для последующего анализа связи изменений показателей иммунной регуляции с вариантными генотипами данного гена проводили с помощью онлайн-калькулятора GenExpert и Microsoft Office Excel 2010.

Результаты и их обсуждение. Среднегодовая концентрация бенз(а)пирена в атмосферном воздухе промышленно развитой территории на севере составляет 0,62 ПДК_сс, на условно чистой территории данного региона – 0,014 ПДК сс ; в промышленном центре на юге – 7,27 ПДК сс , на условно чистой территории – 0,74 ПДК сс ³.

Среднесуточная доза аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном детского населения северного промышленного центра (0,0071 мкг/(кг·день)) превышает значение данного показателя у детей, проживающих на условно чистой северной территории (0,0001 мкг/(кг·день)) ( p = 0,001). В свою очередь, среднесуточная доза экспозиции бенз(а)пиреном детского населения промышленного центра на юге (0,0865 мкг/(кг·день)) достоверно превышает не только аналогичное значение у детей, проживающих на условно чистой территории (0,0083 мкг/(кг·день)), но и у детей, проживающих в промышленном центре на севере ( p = 0,001).

Уровень контаминации крови детей в группе наблюдения на северной территории (0,00224 ± 0,00030 мкг/дм3) превышает аналогичное значение у детей в группе сравнения (0,00112 ± 0,00034 мкг/дм3) и референтный уровень (p < 0,05). Концентрация бенз(а)пирена в крови детей в группе наблюдения на южной территории (0,00225 ± 0,00035 мкг/дм3) также превышает значение данного показателя у детей в соответствующей группе сравнения (0,00109 ± 0,00024 мкг/дм3) и референтный уровень (p = 0,006). Однако уровень контаминации крови бенз(а)пиреном у детей, проживающих в условиях низкодозовой аэрогенной экспозиции бенз(а)пи-реном на северной промышленной территории, дос- товерно не различается с его уровнем у детей, проживающих в условиях высокодозовой экспозиции бенз(а)пиреном на юге (p = 0,98).

Иммунологический профиль обследованного детского населения урбанизированных территорий на севере и юге Сибири характеризуется признаками активации запрограммированной клеточной гибели, сопряженной с формированием специфической гиперсенсибилизации к бенз(а)пирену (табл. 1).

У 43,9 % (231) детей в северной группе наблюдения выявлены признаки гиперэкспрессии белка – онкосупрессора р53 относительно детей в группе сравнения, а также референтного уровня ( p < 0,05). Повышение содержания белка р53 в северной группе наблюдения достоверно ассоциировано с G-аллелем и GG-генотипом гена TP53 (rs1042522) ( OR = 1,37–1,83, p < 0,05) (табл. 2).

Содержание p53 у 54,5 % (205) детей на южной промышленно развитой территории также превышает его уровень у детей в соответствующей группе сравнения ( p < 0,05), что, напротив, ассоциировано с С-аллелем и СС-генотипом гена TP53 (rs1042522) ( OR = 2,17–2,83, p < 0,05).

Уровень экспреcсии белка р53 у детей, проживающих в условиях высокодозовой аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном на юге, в 1,4 раза превышает значение данного показателя у детей, проживающих в условиях низкодозового воздействия бенз(а)-пирена на севере ( p < 0,05). При этом содержание белка р53 у детей, проживающих на условно чистой северной территории, также повышено по отношению к таковому у детей, проживающих на условно чистой южной территории ( p = 0,001).

Таблица 1

Особенности иммунного профиля детского населения севера и юга Восточной Сибири в условиях внешнесредового воздействия бенз(а)пирена

Референтный 4 уровень	Группа наблюдения 1 – север Сибири, n = 526	Группа сравнения 1 – север Сибири, n = 180	p 1	Группа наблюдения 2 – юг Сибири , n = 376	Группа сравнения 2 – юг Сибири, n = 171	p 2
p53, % / p53, %
1,2 –1,8    \	5,42 ± 0,47*      \	4,27 ± 0,29*     \	0,038 \	7,75 ± 0,89*      \	1,87 ± 0,10      \	0,001
IgG к бенз(а)пирену, усл. ед.
0–0,3     \	0,208 ± 0,014     \	0,080 ± 0,02     \	0,001 \	0,212 ± 0,011     \	0,074 ± 0,009     \	0,001

П р и м е ч а н и е: p ₁ – достоверность различий между группой наблюдения и группой сравнения на севере; p ₂ – достоверность различий между южной группой наблюдения и группой сравнения на юге; * – различия с референтным уровнем достоверны ( p < 0,05).

Таблица 2

Частоты аллелей и генотипов гена TP53 (rs1042522) у детского населения севера и юга Восточной Сибири, %

SNP	Генотип / аллель	ν obs          1	ν comp	χ2        1	p 1	OR (95 % CI )
TP53 (rs1042522)	Группа наблюдения 1 (n = 526) / Группа сравнения 1 (n = 180)
	CC	36,1	36,7	3,82	0,049	0,98 (0,69–1,39)
	CG	11,2	25,6			0,37 (0,24–0,57)
	GG	52,7	37,7			1,83 (1,30–2,59)
	C	41,7	49,4	6,49	0,01	0,73 (0,58–0,93)
	G	58,3	50,6			1,37 (1,07–1,74)
	Группа наблюдения 2 (n = 376) / Группа сравнения 2 (n = 171)
	CC	49,5	29,1	9,94	0,002	2,38 (1,59–3,57)
	CG	34,3	54,3			0,44 (0,30–0,65)
	GG	16,2	16,6			0,98 (0,59–1,62
	C	66,6	56,3	8,76	0,003	1,55 (1,18–2,04)
	G	33,4	43,7			0,65 (0,49–0,85)

П р и м е ч а н и е: ν_obs – частоты аллелей и генотипов в группах наблюдения 1 и 2; ν_comp – частоты аллелей и генотипов в группах сравнения 1 и 2.

Установлено повышение уровня продукции специфического IgG к бенз(а)пирену у 73,4 % (386) детей в группе наблюдения 1 и 63,1 % (237) детей в группе наблюдения 2 по отношению к референтному уровню и соответствующим группам сравнения ( p < 0,05). Однако содержание данного маркера у детей в условиях низкодозовой аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном на севере сопоставимо с его уровнем продукции при высокодозовом воздействии бенз(а)пирена на юге ( p = 0,822).

Бенз(а)пирен – высокотоксичный полициклический углеводород (ПАУ) с выраженными цитотоксическими, мутагенными, канцерогенными и нейротоксическими свойствами [10]. Механизмы реализации мутагенных и канцерогенных свойств бенз(а)пирена основываются на ковалентном связывании его метаболита – бенз(а)пирен-7,8-дигид-родиол-9,10-эпоксида (BPDE) с нуклеотидными основаниями и последующим формированием цис- и транс-аддуктов ДНК, что вызывает повреждения нуклеотидной последовательности, нарушения процессов репарации и репликации, трансформацию клетки и, как следствие, ее гибель и / или канцерогенез [11, 12].

Условия окружающей среды на приполярных территориях, в частности, на севере Восточной Сибири, отличаются суровыми и нестабильными природно-климатическими условиями: длительным периодом низких температур, резкими перепадами атмосферного давления, повышенной электромагнитной активностью и радиацией, а также измененным световым режимом – фотопериодической сезонной асимметрией. Экстремальные условия жизни на северных территориях предъявляют высокие требования к работе иммунной и нервной систем организма, обеспечивающих поддержание гомеостаза в нестабильных условиях среды. Повышенная сложность процессов адаптации организма к измененным условиям обусловливает снижение адаптационного потенциала и, как следствие, способствует развитию донозологических изменений иммунного профиля [13, 14].

Белок p53 является транскрипционным фактором – супрессором опухолевого роста, играющим важную роль в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и запрограммированной клеточной гибели – апоптоза. Активация р53 различными повреждающими ДНК агентами и канцерогенами, включая бенз(а)пирен, приводит к остановке клеточного цикла в G1 фазе и запуску репарации ДНК – восстановления путем удаления нуклеотидов – NER (Nucleotide Excision Repair), которая осуществляется посредством активации ингибиторов циклинзависи-мой киназы с21 (CDK-21), а также гена остановки роста и повреждения ДНК GADD45 (Growth arrest and DNA damage). Однако увеличение дозы канцерогена, а также продолжительность его действия увеличивает риск мутации гена-супрессора опухоли p53. Повреждение ДНК в клетке с мутацией не вызывает остановки клеточного цикла или репарации ДНК вследствие нарушения р53-зависимого образования ингибитора циклинзависимой киназы 1A р21, что приводит к ее пролиферации и трансформации в злокачественное новообразование [15, 16].

Выявленное в данном исследовании повышение уровня p53 у детей в условиях изолированного воздействия техногенного фактора – бенз(а)пирена (группа наблюдения 2), измененного климатического фона северной территории (группа сравнения 1) и сочетанного воздействия данных факторов, вероятно, указывает на активацию запрограммированной гибели клеток с поврежденной ДНК в условиях воздействия стрессовых факторов различной природы. Установлено, что высокодозовая экспозиция бенз(а)пиреном на уровне 0,0865 мкг/(кг·день), ассоциированная с С-аллелем и СС-генотипом дикого типа TP53 (rs1042522), обусловливает максимальное повышение уровня экспрессии белка р53 – в 4,1 раза, по отношению к группе сравнения 2. Менее значимое повышение содержания р53 у детей, про- живающих в промышленном центре на севере Восточной Сибири, – в 1,3 раза, вероятно, связано с низким уровнем воздействия бенз(а)пирена – 0,0071 мкг/(кг·день), а также генетической детерминированностью – преобладанием минорного G-аллеля и GG-генотипа гена TP53 (rs1042522). При этом частота G-аллеля гена TP53 (rs1042522) у детей, проживающих в промышленном центре на севере Восточной Сибири, – 58,3 % достоверно превышает средние значения в общемировой (28,6 %), европейской (26,3 %) и азиатской (41,5 %) популяциях5. По данным научной литературы G-аллель гена TP53 (rs1042522) ассоциирован со снижением уровня экспрессии белка p53, угнетением процессов репарации ДНК и апоптоза [17]. Известно, что изолированное воздействие бенз(а)пирена, а также сочетанное воздействие бенз(а)пирена и вакцинного антигена SARS-CoV-2 в эксперименте in vitro активирует экспрессию гена TP53 (rs1042522) в случае гетерозиготного варианта гена CG и, напротив, угнетает его экспрессию у GG-гомозигот [18]. Кроме того, вариантный GG-генотип гена TP53 (rs1042522) может быть ассоциирован с повышенным риском развития онкопролиферативных процессов [19, 20], что особенно важно учитывать в условиях внешнесредового воздействия бенз(а)пирена как вещества с проканцерогенными характеристиками.

Выводы. Уровень контаминации крови бенз(а)-пиреном у детей в условиях внешнесредового воздействия бенз(а)пирена в дозе 0,0071 мкг/(кг·день) на севере Сибири превышает его значение у детей на соответствующей условно чистой территории (p < 0,05) и не различается с его уровнем у детей, проживающих в условиях внешнесредового воздействия бенз(а)пирена в дозе 0,0865 мкг/(кг·день) в южной части региона (p > 0,05). Аналогичная тенденция выявлена для показателей иммунной регуляции. Так, уровень продукции р53 и IgG к бенз(а)пи-рену у детей в условиях низкодозовой аэрогенной экспозиции бенз(а)пиреном на северной территории превышает значения данных показателей у детей на условно чистой северной территории и является сопоставимым с результатами обследования у детей в условиях высокодозового внешнесредового воздействия бенз(а)пирена на южной территории (p < 0,05). Изменения иммунной регуляции у детей, проживающих на урбанизированной территории на севере, ассоциированы с минорными G-аллелем и GG-генотипом гена TP53 (rs1042522) (OR = 1,37–1,83, p < 0,05; RR = 1,17; 95 % CI: 1,07–1,27), в то время как у детей из промышленного центра на юге – с С-аллелем и СС-генотипом дикого типа данного гена (OR = 1,55–2,38, p < 0,05). Ассоциация изменений иммунного профиля детского населения северного промышленного центра с минорными G-аллелем и GG-генотипом гена TP53 (rs1042522), филогенетический аспект которого акцентирован на программе максимальной продолжительности жизненного цикла клетки в условиях «северного стресса» (ограничение функционала онкосупрессора р53), указывает на дополнительный фоновый вклад генетической предрасположенности в формирование более выраженных негативных эффектов бенз(а)пи-рена на северной территории с особым климатическим фоном и световым режимом. Таким образом, выявленные изменения иммунной регуляции у детского населения промышленного центра на северной территории (повышение р53, IgG к бенз(а)пирену), ассоциированные с G-аллелем и GG-генотипом гена TP53 (rs1042522), характеризуют особенности реализации адаптационных реакций иммунной системы к сочетанному воздействию бенз(а)пи-рена, субарктических климатических условий и фотопериодической асимметрии при соответствующей генетической детерминации и, следовательно, могут использоваться в качестве индикаторных показателей риска развития нарушений здоровья (OR = 1,37–1,83, p < 0,05; RR = 1,17; 95 % CI: 1,07–1,27) у детей в условиях аэрогенной экспозиции химическими техногенными факторами на северных территориях.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.