Полиморфизм геномной ДНК однолетних видов подсолнечника

Введение. Подсолнечник является основной масличной культурой в России. Вектор современной селекции сортов и гибридов направлен на увеличение урожая и пищевых качеств семян. Для повышения адаптивности к факторам внешней среды в селекционный процесс часто включают дикорастущие формы подсолнечника. Кроме того, дикорастущие формы – это ценные источники цитоплазматической мужской стерильности и генов-восстановителей фертильности пыльцы [1, 2].

Анализ организации и изменчивости генома высших растений по-прежнему остается одной из наиболее актуальных проблем в генетике. Важным звеном в работе селекционера является четкая идентификация растений на всех этапах селекционного процесса. Сегодня видовую принадлежность образцов подсолнечника из мировой коллекции ВИР устанавливают только с помощью визуальной оценки их морфологических характеристик на основе классификации Ч. Хейзера [3]. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, опреде- ления родства на внутривидовом и родовом уровнях [4, 5]. За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур [6]. Так, для изучения изменчивости генома подсолнечника широко используют метод полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD-PCR), с помощью которого можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному [7, 8, 9, 10, 11]. Для более точного анализа применяют метод SSR или микросателлитного анализа [12].

Кроме того, одним из перспективных подходов в селекции подсолнечника является молекулярно-генетическое маркирование конкретных хозяйственно ценных признаков в генофонде дикорастущих форм рода Helianthus для дальнейшей интрогрессии соответствующих генов в культурные формы методом межвидовой гибридизации. Например, большой интерес представляет поиск новых источников гена Rf 1, восстанавливающего широко используемый в гетерозисной селекции источник ЦМС типа РЕТ1.

В связи с этим целью работы является исследование с помощью молекулярных маркеров внутриродового и внутривидового полиморфизма генома однолетних видов подсолнечника из мировой коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова, создание на основе SSR-анализа генетических паспортов, а также определение методом ПЦР среди однолетних дикорастущих форм гена Rf1 – восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1.

Материалы и методы. Объектами исследования служили образцы однолетних видов подсолнечника H. annuus , H. argophyllus, H. petiolaris , H. debilis и H. praecox из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова, поддерживаемые в живом виде на карантинном питомнике Кубанской опытной станции. В качестве образца сравнения использовали культурную форму подсолнечника H. annuus L. (линия 3629), которая уже более 50-ти лет поддерживается в строгом инцухте. Все исследуемые образцы были классифицированы В.А. Гавриловой с сотрудниками, руководствуясь определителем

Ч. Хейзера [3].

Геномную ДНК выделяли из молодых листьев подсолнечника по методу Р. Бума [13] c нашими модификациями.

RAPD-анализ проводили с 7 праймерами, синтезированными в ЗАО «Синтол» (г. Москва) (табл. 1). Данные праймеры продемонстрировали выявление максимального внутривидового и внутриродового полиморфизма у подсолнечника [9, 10, 11] и обеспечили хорошую воспроизводимость результатов фингерпринтинга в подобранных нами условиях энзиматической реакции. Проведения ПЦР описаны в работе Маркина с соавторами [14].

Таблица 1 – Праймеры, использованные для

RAPD-анализа геномов однолетних дикорастущих видов подсолнечника

Название праймера	Последовательность нуклеотидов 5׳3-׳	Уровень межвидового полиморфизма, %
P36	CCGAATTCGC	36,4
P38	GATACGTTGTC	43,0
OPT-08	AACGGCGACA	38,8
OPW-04	CAGAAGCGGA	50,2
OPW-06	AGGCCCGATG	50,9
OPW-09	GTGACCGAGT	41,5
OPW-10	TCGCATCCCT	42,7
Среднее значение		43,4

Для количественной оценки полиморфизма между исследуемыми видами подсолнечника данные RAPD-анализа с помощью компьютерной программы Phoretix 1D были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков. По матрице состояний с помощью компьютерной программы WinBoot [15] была составлена матрица различий с использованием коэффициента Жаккарда и, используя метод не взвешенных парно-групповых средних (UPGMA), построена дендрограмма, отражающая степень различий между RAPD-спектрами исследуемых видов.

При проведении SSR-анализа использовали десять пар праймеров, отобранных нами в результате предварительных опытов (табл. 2).

Уровень внутриродового полиморфизма (Р) рассчитывали по формуле Р = (число полиморфных фрагментов / общее число фрагментов) × 100 %.

Амплификацию специфических локусов ядерной ДНК HRG01 и HRG02, маркирующих ген Rf1 подсолнечника, проводили с помощью SCAR праймеров – OPK13 и OPY10, разрабо- танных Р. Хорн с сотрудниками [16].

Результаты и обсуждение. В результате RAPD-анализа 41 образца однолетних дикорастущих форм подсолнечника ( Helianthus L.), включающих 5 видов и один контрольный образец (линия культурного подсолнечника 3629 из коллекции НИИ биологии ЮФУ) получены специфические и воспроизводимые наборы фрагментов ДНК (ампликонов). Для всех видов определены индивидуальные RAPD-спектры, различающиеся числом ампликонов, их размерами и степенью выраженности на электрофореграммах. Показано, что количество электрофоретически-подвижных полос (бэндов) зависит от использованного праймера и составляет от 9 до 16, их размеры варьируют в пределах 200-1200 пн. Результаты фингер-принтинга позволили рассчитать уровень внутриродового полиморфизма, который в среднем составил 43,4 % (см. табл. 1).

Построенная UPGMA-дендрограмма выявила генетические взаимоотношения между исследуемыми образцами пяти видов. Как видно на рисунке 1, все исследованные образцы сгруппировались по трем основным кластерам: первый объединяет образцы вида H. argophyllus ; второй – H. annuus , H. petiolaris , H. debilis и H. praecox ; третий представлен культурной формой H. annuus (линия 3629). На дендрограмме практически все образцы одного вида группируются с высокой степенью статистической достоверности: образцы вида H. ar-gophillus – 86-100 %, H. annuus – 52-100 %, Н. petiolaris – 38-100 %, H. debilis – 34-100 % и H. praecox – 59-100 %. Низкие значения бутстрепа (11-34 %) в узлах кластеров межвидовых связей, а также генетические различия (0,25-0,35) указывают на значительный молекулярногенетический полиморфизм однолетних видов подсолнечника. Интересно, что культурная форма вида H. annuus (линия 3629) формирует отдельный кластер. Необходимо отметить, что образцы одного вида, интродуцированные в разные годы из географически отдаленных ареалов своего естественного происхождения, характеризуются значительными различиями RAPD-спектров. Так, например, полиморфизм RAPD-маркеров некоторых образцов в пределах вида H. petiolaris и H. debilis составил 29 и 31 %, а их внутривидовые связи поддержаны низкими значениями бутстрепа – 38 и 34 % соответственно (риc. 1).

Таблица 2 – Праймеры, использованные для SSR-анализа геномов однолетних дикорастущих видов подсолнечника

Название локуса	Повтор	Последовательность нуклеотидов 5׳3 -׳	Уровень межвидового полиморфизма, %
Ha 432	(GT) 10	CTT TAT CCC CCA CCC CCT CC GGG TTT AGT GGC CAG TAG TTG TC	45,3
Ha 1442	(ATT) 31	GCT TAT GTG CTT ACG TGT TCC TG CTA AAC AGT TCG GCG AGT GTA GG	70,3
Ha 1608	(ATT) 25	GAT CTT AGG TCC GCC AC GAT GGC ATT TGG CTA GAC	35,8
IUB 4	(AT) n	GGC CAT GAT TTA TTC ACT CAG ACA GAT GAG AGG CGT TCT CAC	59,7
ORS 509	(AT) (GT)	CAA CGA AAA GAC AGA ATC GAA A CCG GGA ATT TTA CAA GGT GA	38,8
OSU-1	(AGG)	ACA AGT CGG CTG GTG AGC ACA TGA AAC ACG AGC TAA ACC A	51,6
Ha 1287	(GA) 26	GAT ATG AGC CCA TCA CTC ATC GAA GAT ATG TCA GGT CAC ACC C	39,7
HNCA-1	(GT) n	TTG GAG ATG TGT TTG TGT TCTGAG ACC TAC ACC TTA GTT AAA CCTTGC	50,0
HNCA-2	(GT) n	TGA GAC AAG CAT AAG CAC TAG ACA AGA CAA GGG ACT	39,3
Ha 514	(GA) 13	GGT CAA CGG ATT TAG AGT C GTA TTG ATT CCA ACA TCC AG	30,7
Среднее значение			46,1

1000 5513

1000 5512

1000 5514

1000 5511

1805 5504

1805 5501

1805 5503

1805 5502

H. argophylus

3629 □ H. annuus

94 441245 4554

441245 4553 441245 4551 441183 4363 441183 4362

441183 4361

441236 4523 441236 4522 441236 4521 440560 5254

440560 5252 440560 5251 w/n 5352 w/n 5351 w/n 5353

503232 5342 503232 5341 503232 5333 503232 5331

545666 5392 545666 5393 545666 5391

100 560395 5092

560395 5091

560395 5093

560388 5081

560388 5083

560388 5082

560400 5442

560400 5441

560400 5052

560400 5051

—I------------------------ 1------------------------1------------------------1------------------------1------------------------ 1------------------------ 1

0.30       0.25       0.20       0.15       0.10       0.05       0.00

H.

H.

H.

H.

H.

annuus

petiolaris

debilis

debilis

praecox

Примечание: цифрами в узлах кластеров обозначены значения бутстрепа.

Рисунок 1 – Дендрограмма межвидовых и внутривидовых взаимоотношений однолетних дикорастущих видов подсолнечника

Полученные результаты свидетельствуют, что исследованные RAPD-маркеры наряду с морфологическими признаками могут быть эффективно использованы для идентификации образцов однолетнего дикорастущего подсолнечника.

Результаты амплификации микросателлит-ных последовательностей ДНК 31 генотипа показали, что из ранее отобранных 12 SSR-маркеров только 10 проявили себя как полиал-лельные, хорошо воспроизводимые и информативно значимые. При изучении данной группы генотипов по 10-ти праймерам всего была выявлена 21 аллель. Число аллелей на локус варьировало от 2 до 8, а уровень внутриродового полиморфизма – от 30,7 % по локусу Ha 514 до 70,3 % по локусу Ha 1442 (см. табл. 2). В среднем, при сравнении с RAPD-маркерами, он оказался выше на 3 % и составил 46,1 %. В результате SSR-анализа для каждого образца на основании полученного набора аллелей микросателлитных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта или генетические формулы генотипов (табл. 3).

Таблица 3 – Генетические формулы однолетних дикорастущих видов подсолнечника на основе SSR-анализа их генотипов

Форма	Формула*
Helianthus annuus L. (441183)	A 2 B 3 C 2 D 2 E 1 F 4 G 3 H 1 J 2 K 1
Helianthus annuus L. (441236)	A 2 B 3 C 1 D 2 E 1 F 2 G 2 H 1 J 2 K 1
Helianthus annuus L. (441245)	A 1 A 2 B 2 C 1 D 1 E 1 F 2 G 3 H 1 J 1 K 1
H. praecox Englem. & Gray (560400)	A 1 A 2 B 1 C 1 D 1 E 1 E 2 F 3 F 4 G 2 G 3 G 5 H 1 J 1 J 2 K 1
H. debilis Nutt. (560388)	A 1 B 2 C 1 D 1 E 2 F 4 G 1 H 1 J 1 K 1
H. debilis Nutt. (560395)	A 2 B 1 C 1 D 1 E 2 F 4 G 1 H 1 J 1 K 2
H. debilis Nutt. (545666)	A 1 B 2 C 1 C 2 D 0 E 1 F 4 G 1 H 1 J 1 K 1
H. petiolaris Nutt. (440560)	A 1 B 3 C 2 D 1 E 1 F 7 G 3 H 1 J 1 K 1
H. petiolaris Nutt. (503232)	A 1 B 2 C 2 D 1 E 1 F 4 G 1 G 3 H 1 J 1 K 1
H. petiolaris Nutt. (без номера)	A 1 B 2 C 2 D 1 E 1 F 7 G 1 G 4 H 1 J 1 K 1
H. argophyllus T. & G. (1805)	A 0 B 1 C 2 D 1 E 1 F 3 G 1 G 2 H 1 J 1 K 0
H. argophyllus T. & G. (1000)	A 0 B 3 C 2 D 1 E 1 F 3 G 1 G 2 H 1 J 1 K 0
H. annuus L. (линия 3629)	A 1 B 3 C 1 D 2 E 1 F 6 G 1 H 1 J 1 K 1

* Примечание : код локуса – A-Ha 432; B-Ha 1442; C-Ha 1608; D-IUB 4; E-ORS 509, F-OSU-1, G-Ha 1287, H- HNCA-1, J- HNCA-2, K-Ha 514

С целью определения наличия доминантного гена-восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 – Rf 1 у однолетних видов подсолнечника был проведен молекулярно-генетический анализ их ДНК на присутствие двух маркерных участков – HRG01 и HRG02.

В результате амплификации ДНК с праймерами ОРK13 маркер HRG01 был выявлен у всех растений видов H. debilis , H. argophyllus и H. petiolaris (табл. 4). У вида H. debilis (560395)

амплификацию маркерного фрагмента размером 426 п.н. (характерным для культурных и многолетних дикорастущих форм) удалось провести только при снижении температуры отжига праймера с 58 до 54 ºС. У видов H. praecox и H. annuus выявлена гетерогенность по наличию данного маркера как среди образцов разных лет интродукции, так и внутри одного образца. В частности, маркер был обнаружен у 75 % исследованных растений вида H. praecox (560400) и вида H. annuus (441236), а также у   50 % рас тений H. annuus (441245).

При использовании праймера OPY10 амплификацию маркерного фрагмента ДНК (размером 738 п.н.) HRG02 наблюдали у растений H. annuus с наличием внутрипопуляционного полиморфизма: 25 % у образца 441183 и по 50 % у образцов 441236 и 441245. Кроме этого, маркер был определен у 25 % исследованных растений вида H. petiolaris 440560 (табл. 4).

Таблица 4 – Результаты амплификации маркеров гена Rf1 HRG01 и HRG02 у однолетних видов подсолнечника

Вид	Номер интродукции	Наличие маркера HRG01	Наличие маркера HRG02
Helianthus annuus L .	441183	+	+/-
	441236	+/-	+/-
	441245	+/-	+/-
H. praecox Englem. & Gray	560400	+/-	-
H. debilis Nutt.	560388	+	-
	560395	+	-
	545666	+	-
H. petiolaris Nutt.	440560	+	+/-
	503232	+	-
	Без номера	+	-
H. argophyllus T. & G.	1805	+	-
	1000	+	-

Следовательно, SCAR-маркеры гена Rf 1 в большинстве случаев неоднородно представлены среди различных дикорастущих популяций однолетних видов. В связи с этим на этапе исходных форм для получения новых доноров восстановителей фертильности пыльцы необходимо проведение предварительной оценки растений на наличие этих маркеров.

Таким образом, приведенные результаты молекулярно-генетического полиморфизма однолетних видов подсолнечника свидетельствуют, что исследованные RAPD-, SSR- и SCAR-маркеры, наряду с классическим фенологическим описанием растений, удобно использовать для генетического контроля «чис- тоты» и целостности коллекционных образцов подсолнечника, а также для идентификации генотипов с хозяйственно ценными признаками.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).