Получение гетерозисных гибридов на основе новых ЦМС линий подсолнечника

Введение. Главным направлением селекции подсолнечника ( Helianthus annuus L . ) является получение гетерозисных гибридов [1, 2, 3, 4]. Для их промышленного производства используют материнские линии на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы ( Rf ) [5, 6].

В настоящее время в коммерческом производстве семян подсолнечника доминируют гетерозисные гибриды, полученные на основе ЦМС типа РЕТ1, открытой у межвидового гибрида H. petiolaris × H. annuus П. Леклерком еще в 1966 г. [7]. Такое унифицированное использование ЦМС РЕТ1, безусловно, уменьшает генетическую изменчивость цитоплазмы этой масличной культуры, что может привести к негативным явлениям, например, массовым эпифитотиям. Аналогичный случай уже имел место при широкомасштабном поражении гельминтоспориозом гибридов кукурузы с техасским типом ЦМС, тогда как другие типы ЦМС оказались менее восприимчивы к этому заболеванию [8]. Следовательно, для создания новых систем ЦМС- Rf с целью увеличения генетического разнообразия и уменьшения опасной унификации семенного материала актуален поиск и внедрение в гетерозисную селекцию новых источников ЦМС и соответственно восстановителей фертильности пыль.цы [9, 10]. В связи с этим целью работы является изучение влияния нового типа ЦМС – RIG0 (на основе цитоплазмы подсолнечника H. rigidus ) на формирование хозяйственно полезных признаков у гибридов F 1 и их материнских форм. В качестве объекта сравнения использовали фертильный и стерильный на основе ЦМС РЕТ1 аналоги линий.

Материал и методы. Полевые исследования проводили на Кубанской опытной станции ВНИИР им. Н.И. Вавилова в 2007 и 2008 гг. Для анализа были отобраны две инбредные линии на основе ЦМС РЕТ1 селекции Всероссийского института растениеводства: ВИР 109 и ВИР 151 (15-го и

18-го поколения инцухта соответственно). Путем восьмикратного беккроссирования исходного образца со стерильной цитоплазмой на основе H. rigidus с использованием пыльцы фертильных аналогов ВИР 109 и ВИР 151 получены линии ЦМС RIG0 [4]. Таким образом, материалом для исследования служили линии с одинаковым ядерным геномом и различными цитоплазмонами, каждая из которых была представлена тремя аналогами: один – с фертильной цитоплазмой и два других – со стерильными РЕТ1 и RIG0 цитоплазмами. С целью изучения влияния ЦМС RIG0 на формирование хозяйственно ценных признаков стерильные аналоги скрестили с 4-мя линиями-восстановителями фертильности пыльцы: ВИР 160, ВИР 365, ВИР 637 и RIL 130, переданной из INRA (Франция). У родительских форм и гибридов F 1 измеряли продолжительность фенофаз, высоту растений, диаметр корзинки и массу 1000 семян. В таблицах представлены средние величины измерений не менее 30 растений для каждого опыта и стандартная ошибка. Для определения урожайности гибриды высевали в трех повторностях по 5 рядов, с расстоянием между рядами 70 см и между растениями в одном ряду 35 см. При подсчете урожая для гарантии равномерного воздействия факторов окружающей среды учитывали растения только трех средних рядов. Достоверность отличий определяли по t-критерию Стьюдента [13].

Фертильность пыльцы определяли ацетокарминовым методом [9, 12]. Жирно-кислотный состав масла из семян линий-аналогов определяли методом газо-жидкостной хроматографии согласно ГОСТ Р 51483-99. Получение метиловых эфиров жирных кислот проводили по ГОСТ Р 51486-99. Метиловые эфиры определяли на хроматографе «Кристалл» (модель 2000М) с ионизационно-пламенным детектором и кварцевой капиллярной колонкой (длина 30 м, диаметр 0,32 мм), заполненной карбоваксом 20М, с нанесенной на него ортофосфорной кислотой. Температура колонки 230 °С, испарителя – 250 °С. Газ-носитель – азот. Скорость газа-носителя 50 см/сек. Идентификацию и количественное определение метиловых эфиров осуществляли при помощи аналитических стандартов. В таблице даны средние значения трех измерений для каждого варианта опыта.

Результаты и обсуждение. В таблице 1 приведены показатели продолжительности периода всходы–цветение и вегетационного периода, высоты растений, диаметра корзинки и массы 1000 семян трех аналогов линий ВИР 109 и ВИР 151.

По продолжительности вегетационного периода все аналоги линии ВИР 109 можно отнести к среднеспелым, а линии ВИР 151 – к раннеспелым. ЦМС растения на основе RIG0 зацветали и созревали на 1-3 дня раньше фертильных и ЦМС РЕТ1 форм у обеих исследованных линий.

Растения линии ВИР 109 с цитоплазмой RIG0 по высоте не отличались от фертильных и превосходили РЕТ1 аналог на 3,5 %. В свою очередь ЦМС РЕТ1 растения ВИР 109 были ниже фертильных на 2,8 %. Отмечено увеличение диаметра корзинки у линии ВИР 151 с ЦМС RIG0 по сравнению с РЕТ1 формой на 11,4 %. В то же время растения ЦМС РЕТ1 уступали по размеру корзинок фертильному аналогу на 10,1 %.

Таблица 1 – Морфофизиологическая характеристика ЦМС линий и их фертильных аналогов

КОС ВИР, 2007-2008 гг .

Линия	Период от всходов до цветения – созревания, дни	Высота растений, см	Диаметр корзинки, см	Масса 1000 семян, г
ВИР 109   Ферт.	63/111	133,7±1,3	17,5±0,5	87,2±1,7
РЕТ1	63/111	130,0±1,4*	18,3±0,5	88,5±2,4
RIG0	62/108	134,7±2,2^	17,1±0,8	84,4±1,8
ВИР 151   Ферт.	61/103	129,8±2,3	13,8±0,3	68,2±0,7
РЕТ1	62/104	128,3±1,9	12,4±0,3*	73,2±1,7*
RIG0	59/102	132,4±1,5	14,0±0,4^	71,0±2,0*

* - достоверное отличие по сравнению с фертильной формой при P < 0,05;

^ - достоверное отличие по сравнению с РЕТ1 аналогом при P < 0,05

Отличия также выявлены по массе 1000 семян для стерильных аналогов линии ВИР 151 относительно фертильной формы: семянки ЦМС RIG0 аналога крупнее на 4,1 %, а РЕТ1 – на 7,3 %.

Известно, что масло семян подсолнечника включает четыре основные кислоты: линолевую, олеиновую, стеариновую и пальмитиновую. В общем их процентное соотношение у исследованных линий-аналогов соответствует средним показателям, характерным для культурных форм подсолнечника [14, 15, 16]. Наиболее высокое содержание отмечено для линолевой кислоты – свыше 50 % у всех линий. Олеиновой кислоты содержится около 30 %, а пальмитиновой и стеариновой – от 4 до 6 %. Содержание насыщенных кислот (стеариновая, пальмитиновая, бегеновая, арахиновая, лигноцериновая) составляет в среднем 12,6 %. Среднее содержание мононенасыщенных жирных кислот (олеиновая, гондоиновая, пальмитолеиновая, эруковая) составляет 31,0 %, полиненасыщен-ных (линоленовая) – 56,5 %. При сравнении жирно-кислотного состава семян аналогов линий ВИР 109 и ВИР 151 наибольшие различия между фертильной и стерильными формами отмечены для ВИР 109, у которой стерильные RIG0 и РЕТ1 аналоги превосходили фертильный по содержанию линолевой кислоты на 4,6 и 10,6 % соответственно (табл. 2). Содержание олеиновой кислоты в масле семян линии ВИР 109 РЕТ1, напротив, было на 7,3 % меньше фертильного аналога. Содержание насыщенных жирных кислот у фертильного аналога ВИР 109 составило 14,2 %, что превышает этот показатель у RIG0 и PET1 аналогов на 3,2 и 2,7 % соответственно. По содержанию мононенасыщенных жирных кислот фертильная ВИР 109 (33,7 %) также превосходила стерильные формы: RIG0 на 1,1 %, а РЕТ1 – на 7,7 %. Семена аналогов линии ВИР 151 по жирно-кислотному составу практически не различались.

Таблица 2 - Содержание некоторых жирных кислот в семенах линий-аналогов КОС ВИР, 2008 г.

Жирная кислота	ВИР 151			ВИР 109
	Ферт.	РЕТ1	RIG0	Ферт.	РЕТ1	RIG0
Пальмитиновая	5,6	5,4	5,4	7,4	6,0	5,7
Пальмитолеиновая	0,1	0,1	0,1	0,2	0,1	0,1
Стеариновая	5,9	5,9	5,7	5,4	4,2	4,0
Олеиновая	29,2	31,7	31,7	32,9	25,6	32,2
Линолевая	57,4	55,2	55,5	51,8	62,4	56,4
Арахиновая	0,4	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
Гондоиновая	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Бегеновая	0,8	0,9	0,9	1,0	0,8	0,8
Эруковая	0,1	0,1	0,1	0,5	0,2	0,2
Лигноцериновая	0,2	0,2	0,2	0,1	0,2	0,2

Таким образом, у двух исследованных линий различные типы стерильных цитоплазм оказали влияние на разные морфофизиологические признаки растений. Это является очередным подтверждением факта, что формирование фенотипа есть результат тонко скоординированного действия генов ядра и цитоплазмы. В основном количественные показатели у линий с ЦМС RIG0 не отличались от других аналогов или превосходили их, за исключением содержания линолевой кислоты в масле семян линии ВИР 109, у которой РЕТ1 аналог по этому показателю превзошел RIG0 и фертильную формы.

Сравнительный анализ 4-х линий-восстановителей фертильности пыльцы, результаты которого приведены в таблице 3, свидетельствует, что сроки цветения у изученных линий колеблются от 56 (ВИР 637) до 61 дня (ВИР 365) и созревания от 96 (RIL 130, ВИР 673) до 108 дней (ВИР 365) соответственно. В целом фазы цветения восстановителей и материнских стерильных форм совпадают по времени, что является необходимым фактором для эффективного опыления.

При изучении показателей габитуса отмечено, что наибольший диаметр корзинки (15,1±0,4 см) и высота растений (171,5±1,2 см) характерны для линии ВИР 365. Самой низкорослой оказалась линия ВИР 793 (93,9±1,4 см). Показатель массы 1000 семянок, отражающий размер семян у исследованных линий, находится в пределах от 27,6±0,6 г (линия RIL 130) до 45,8±0,9 г (линия ВИР 365).

Фертильность пыльцы всех исследованных восстановителей была более 80 %. Наибольшая фертильность (98,2±0,7 %) отмечена у линии ВИР 637, наименьшая – у линии ВИР 160 (82,3±5,5 %).

Таким образом, линия ВИР 365 по высоте растений, диаметру корзинки и массе 1000 семян превышает все исследованные линии-восстановители. Очевидно, это связано с тем, что из 4-х проанализированных линий только у ВИР 365 отсутствует ветвление.

С целью изучения влияния различных типов ЦМС на формирование морфофизиологических и хозяйственных признаков у гибридов, полученных в результате скрещиваний ЦМС линий аналогов ВИР 109 и ВИР 151 с цитоплазмами РЕТ1 и RIG0 с вышеописанными восстановителями (табл. 3), проведен сравнительный анализ по следующим показателям: продолжительность вегетационного периода, высота растений, диаметр корзинки и урожайность.

Таблица 3 — Морфофизиологические показатели линий-восстановителей фертильности пыльцы

КОС ВИР, 2007-2008 гг.

Линия	Период от всходов до цветения – созревания, дни	Высота растений, см	Диаметр корзинки, см	Масса 1000 семян, г	Фертильность пыльцы, %	Ветвление
RIL 130	58/96	121,0±0,9	9,4±0,2	27,6±0,6	97,9±0,3	Есть
ВИР 365	61/108	171,5±1,2	15,1±0,4	45,8±0,9	92,2±2,9	Нет
ВИР 637	56/96	103,4±0,9	10,1±0,2	31,6±0,6	98,2±0,7	Есть
ВИР 160	60/101	118,3±1,6	10,2±0,2	29,3±1,5	82,3±5,5	Есть

Таблица 4 – Хозяйственно ценные показатели гибридов подсолнечника

КОС ВИР, 2007-2008 гг.

Гибрид	Период от всходов до цветения/ созревания, дни		Урожайность семян, т/га		Высота растений, см		Диаметр корзинки, см
	RIG0	РET1	RIG0	РET1	RIG0	РET1	RIG0	РET1
ВИР 109 × RIL 130	54/95	54/95	3,31±0,03	3,40±0,05	179,1±2,9	181,6±2,3	17,7±0,9	19,8±0,8
ВИР 109 × ВИР 365	57/101	57/101	3,72±0,06	3,68±0,03	187,1±1,4*	179,8±1,8	16,2±0,4*	18,2±0,6
ВИР 151 × ВИР 637	55/94	55/94	3,47±0,08	3,32±0,08	165,4±2,0	164,9±1,7	18,2±0,5	17,4±0,5
ВИР 151 × ВИР 160	55/94	55/94	3,37±0,05	3,10±0,05	154,5±2,1	153,8±1,8	15,9±0,6	16,4±0,5

- достоверные отличия RIG0 по сравнению с РЕТ1 аналогом, при P < 0,05

Как видно из данных таблицы 4, гибрид ВИР 109 × ВИР 365 на основе ЦМС RIG0 отличается от своего аналога на основе РЕТ1 большей высотой растений (на 3,9 %) и меньшим диаметром корзинки (на 12,4 %). Другие гибриды-аналоги на основе двух разных типов ЦМС по показателям габитуса сходны. По срокам вегетации и урожайности гибриды с цитоплазмоном RIG0 не отличаются от своих РЕТ1 аналогов и относятся к категории раннеспелых. Наибольшая урожайность и высота растений среди изученных гибридных комбинаций отмечена у комбинаций ВИР 109 × ВИР 365 на основе обеих типов цитоплазм, однако у этих гибридов фаза цветения и полного созревания наступает на 2-3 и 6-7 дней соответственно позднее, чем у других гибридных растений.

Таким образом, гибриды на основе ЦМС RIG0 по исследованным хозяйственно ценным признакам практически не уступают аналогичным гибридам на основе ЦМС РЕТ1. Следовательно, материнские формы на основе ЦМС RIG0 наряду с классическим РЕТ1 можно рекомендовать для коммерческого производства семян подсолнечника.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).