Получение гибридов между рапсом яровым и горчицей белой методом эмбриокультуры

Введение. Расширение посевных площадей под яровым рапсом ( Brassica napus L.) приводит к увеличению повреждения его многими насекомыми-вредителями (крестоцветной блошкой, рапсовым цветоедом, семенным скрытнохоботником, капустной тлей и другими) и грибными патогенами, вызывающими такие заболевания, как альтернариоз, фузариоз, фомоз. Это требует интенсивного применения химических средств защиты.

Гибриды между рапсом и горчицей белой давно вызывают интерес селекционеров, поскольку получены гибриды, отличающиеся устойчивостью к Al-ternaria (Ripley, Arnison, 1990; Klewer et al ., 2002), к повреждению капустным долгоносиком ( Ceutoryhn-chus assimilis Paykull) (Mc Caffrey et al. , 1999) и капустной тлей ( Brevicoryne brassicae ).

С целью переноса устойчивости к вредителям в полевых условиях ВНИПТИ рапса проводили реципрокные межродовые скрещивания горчицы белой ( Sinapis alba L., 2n=24, сорт R 166) c линией рапса F 3 (6B X (CHk198 X L159) X (ВНИИМК 162 X ВНИИМК 109), где 6B – ресинтезированный рапс (2n=38), полученный от скрещивания B. narinosa и B. oleracea.

Материалы и методы. Опыление цветков проводили в день кастрации. Для получения гибридов использовали эмбриокультуру. Незрелые зародыши вводили в культуру in vitro на разных стадиях развития (5, 7, 10, 13 и 17 дни после опыления). Культивирование осуществляли на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением 30 г/л сахарозы, 6-бен-зиламинопурина (6-БАП), кинетина, гибберелловой кислоты (ГК), a-нафтилуксусной кислоты (НУК) и гидролизата казеина в различных количествах и соотношениях. Полученные проростки клонировали, укореняли и пересаживали в грунт.

Морфологическое описание гибридов осуществляли по методике ВИР (Корнейчук, 1983). Повторность каждого опыта трехкратная. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ (Доспехов, 1985).

Оценку повреждения растений тлей проводили с помощью трехбалльной шкалы:

• 1    балл – слабая заселенность (на растении встречаются отдельные экземпляры вредителя, не образующие колоний, или заселено менее 25 % поверхности листьев);

• 2    балла – средняя заселенность (на растении отмечены одна-две колонии или заселено 26-50 % поверхности листьев);

• 3    балла – сильная заселенность (на растении встречается более чем две колонии, заселено более 50 % всей поверхности листьев).

При отсутствии вредителя на растении – заселение нулевое (0) (Поляков и др., 1995).

Результаты и обсуждение. Получение истинных межродовых гибридов между горчицей белой и рапсом в полевых условиях затруднено. Эффективность отдаленной гибридизации рапса и горчицы белой в прямом и в обратном скрещиваниях оказалась 1,2 и 0,2 % соответственно. В дальнейшем в условиях in vivo семена или не образовывались совсем, или из-за гибели зародышей становились стерильными и невыполненными.

В результате применения культуры незрелых зародышей регенерация с частотой 1,9 % получена только в комбинации скрещивания рапс яровой × горчица белая, что подтверждает литературные данные о более успешной гибридизации между многими видами рода Brassica , если в качестве материнского растения выступают высокохромосомные виды (Жидкова, Шапошникова, 2005). Однако наши результаты не согласуются с данными Ripley о получении истинных гибридов в случае, если горчица белая взята в качестве материнской формы (Ripley, Arnison, 1990).

Максимальная частота регенерации (3,5 %) получена у зародышей, изолированных на 17-й день после опыления. Помимо возраста экспланта важным фактором при культивировании гибридных зародышей в условиях in vitro являлся состав питательной среды. Было установлено, что большое количество цитокининов в варианте среды № 2 (6-БАП – 0,3 мг/л, кинетин – 0,1 мг/л) снижало частоту регенерации до 1,1 %, а количество нормально развитых проростков – до 0,7 % (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние состава среды на жизнеспособность гибридных зародышей в условиях in vitro (ВНИПТИР, 2007)

Вариант сред	Соотношение гормонов: БАП : кинетин : НУК : ГК : гидролизат казеина	Получено проростков, %
		всего	нормально развитых
1 (st)	Без гормонов	0	0
2.	0,3 : 0,1 : 0 : 0,1 : 0	1,1	0,7
3.	0,3 : 0 : 0,1 : 0 : 0	3,2	1,4
4.	0,3 : 0 : 0,1 : 0,1 : 0	4,5	3,3
5.	0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 0	12,3	12,0
6.	0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 300	6,8	5,4
7.	0,2 : 0 : 0,1 : 0,2 : 30	8,9	6,7
	НСР 05 =	1,03	НСР 05 =0,09

Добавление НУК и ГК стимулировало регенерацию 4,5 % зародышей. Уменьшение концентрации 6-БАП с 0,3 до 0,2 мг/л, а также увеличение концентрации ГК до 0,2 мг/л позволило получить максимальное количество нормально развитых проростков (12,0 %). При этом добавление 300 мг/л гидролизата казеина снижало общее количество полученных проростков с 12,3 до 6,8 %. Таким образом, оптимальным оказалось содержание в составе среды 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.

Около 67 % гибридных растений, полученных от скрещивания рапса и горчицы белой, обладали низкой жизнеспособностью и в культуре in vitro , и в условиях закрытого грунта.

Выжившие гибридные растения рапса и горчицы белой на стадии 2-3 листьев морфологически отличались от растений рапса ярового и были сходны с отцовской формой (горчицей белой) по степени опушения и антоциановой окраске семядолей (рис. 1).

А

Б

Рисунок 1 – Гибрид “рапс яровой x горчица белая”, полученный посредством эмбриокультуры (А), и растение рапса ярового (Б) в условиях in vitro

Цитологическое изучение подтвердило гибридную природу полученных растений. Подсчет числа хромосом в клетках кончика корня показал, что оно варьировало в пределах от 27 до 33.

Проведенное в полевых условиях морфологическое описание гибридов F 1 между горчицей белой и рапсом яровым показало промежуточное наследование некоторых признаков (табл. 2).

Промежуточное наследование таких признаков, как характер изгиба верхушки листа и опушенность края первого листа согласуется с описанными ранее нашими данными (Жидкова, Шапошникова, 2005).

У гибридных растений в условиях in vitro наблюдалось промежуточное наследование таких признаков, как число долей, волнистость и зубчатость края нижних листьев (рис. 2).

Рисунок 2 – Форма листа горчицы белой (А), гибрида “рапс яровой x горчица белая” (Б) и рапса ярового (В)

Полученные гибриды характеризовались большим числом ветвей первого порядка (до 12 шт.) и обильным цветением. При их скрещивании с яровым рапсом наблюдалось завязывание семян и образование стручков с промежуточной между родительскими формами длиной створки.

Среди гибридных растений между рапсом яровым и горчицей белой выявлены образцы (28 %), устойчивые к тле, на которых отмечалась наименьшая плотность заселения растений (1 балл, менее 25 % поверхности листьев) наряду с растениями горчицы белой. На остальных экземплярах в зависимости от генотипа данный показатель колебался от 2650 % (2 балла) до более 50 % (3 балла) заселенности всей поверхности листьев тлей. Предполагается, что устойчивость к тле связана с опушением гибридов, которое они унаследовали от отцовской формы (горчицы белой).

Таблица 2 – Промежуточное наследование некоторых признаков гибридов F₁ рапса ярового и горчицы белой (ВНИПТИР, 2007)

Признаки	Brassica napus	F 1 Brassica napus × Sinapis alba	Sinapis alba	НСР 05
1. Семядоли, мм: ― длина ― ширина	6,9 ± 0,27 13,8 ± 0,41	7,2 ± 0,13 15,9 ± 0,74	7,6 ± 0,71 18,1 ± 0,33	0,69 0,81
2. Морфология листа: ― число долей ― опушенность края первого листа ― характер изгиба верхушки	4,5 ± 0,65 Редкая Средний	4,9 ± 0,73 Средняя Слабый	5,8 ± 0,17 Густая Отсутствует	0,34 ―
3. Опушенность стебля	Отсутствует	Слабая	Сильная	―
4. Высота ветвления, см	47,3 ± 1,93	40,0 ± 1,13	35,4 ± 1,65	1,89
5. Длина створки стручка, мм	54,1 ± 0,29	17,6 ± 0,67	14,7 ± 0,65	1,31

• 2.    Klewer A. Transfer of Alterna-ria resistance from related species into Brassica napus L. – Электрон. дан.    –    Режим    доступа:

• 3.    McCaffrey J. P ., Harmon B. L., Brown J., A.P. Assessment of Sinapis alba, Brassica napus and Si-napis alba B. napus hybrids for resistance to cabbage seedpod weevil, Ceutorhynchus assimilis ( Coleopte-ra: Curculionidae ).

• 4.    Brown, J. B. Davis // J. of Agric. Sci. – 1999. – Vol. 132. – P. 289-295.

• 5.    Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Physiol. – 1962. – Vol. 15. –

• 2. Среди полученного в ходе применения эмбриокультуры гибридного материала выделены образцы, устойчивые к тле, которые могут использоваться в селекции ярового рапса.

/2005/259/index

Выводы. 1. В культуре незрелых зародышей, полученных от скрещивания рапса ярового и горчицы белой, максимальный уровень регенерации обеспечивается 17-дневным возрастом зародыша и культивированием на среде MS, содержащей 0,2 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК и 0,2 мг/л ГК.