Получение и характеристика моноклональных антител, специфичных к структурным белкам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней

В связи с этим целью нашей работы было получение линии гибридомных клеток, стабильно секретирующих моноклональные антитела, специфичные к структурным белкам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, а также оценка пригодности полученных МА для создания иммунореагентов.

Описание методики . Штаммы вируса ТГС и РКВС были адаптированы к росту в монослое культур следующих клеток: штамм Д-52 (вирус ТГС) — перевиваемые тестикулы поросенка (ПТП) и почки плода свиньи (СПЭВ), почки свиньи (РК-15), почки сибирского горного козерога (ПСГК); вакцинный штамм Lindholm (вирус ТГС) — ПТП, СПЭВ, РК-15, ПСГК; штамм ЛУК (РКВС) — ПТП, СПЭВ; инфекционный титр этих штаммов составлял соответственно 6, 5 и 6-6,5 lg ТЦД_50/мл.

Для получения МА, специфичных к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, расположенным на пепломерном гликопротеине вириона, было необходимо индуцировать максимальный иммунный ответ на поверхностные антигены этого возбудителя у мышей линии BALB/c — доноров иммунных спленоцитов. Для этого мышей линии BALB/c иммунизировали препаратом очищенного вируса ТГС. Введение антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно и внут-риселезеночно 4 раза с промежутком 14 сут (табл. 1). Первое введение осуществляли с полным, второе — с неполным адъювантом Фрейнда, последующие — без адъюванта. Бустер-дозу антигена вводили внутриселезеночно или внутривенно. Для определения интенсивности иммунного ответа на антигены возбудителя исследовали сыворотки крови мышей непрямыми методами твердофазного (ТФ ИФА) и гистохими-114

ческого (ГХ ИФА) иммуноферментного анализа, а также по реакции нейтрализации (РН).

1. Оценка эффективности различных схем иммунизации мышей линии BALB/c антигенами вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней

Способ  введения  антигена (доза)	Схема иммунизации			Титр
	I	: II i III i	IV
	Время	введения антигена, сут		ГХ ИФА i	ТФ ИФА	i РН
Подкожное (3 мкг с ПАФ)	1	1               1	1	–	–	–
Подкожное (3 мкг с НАФ)	14	14        14	14	–	–	–
Внутривенное (1 мкг) Внутривенное (1 мкг)	28	28 42		1:128 1:256	1:4000 1:8000	1:64 1:128
Внутриселезеночное (1 мкг) Внутриселезеночное (1 мкг)		28	28 42	1:128 1:256	1:4000 1:8000	1:256 1:1028
П р и м е ч а н и е. Прочерк означает, что титр не проверяли. ПАФ адъювант Фрейнда.			и НАФ — соответственно полный			и неполный

Гибридизацию клеток проводили по методу Kohler с соавт. (7), клонирование гибридных клеток — в полужидком агаре по методу Gooding (8). Для скрининга гибридом непрямым ТФ ИФА в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы использовали лизаты интактных и инфицированных вирусом ТГС и РКВС клеток ПТП. Антиген сорбировали на 96-луночных пластинах в дозе 2 мкг на одну лунку с использованием фосфатно-солевого буфера (ФБР). Разведение антител и пероксидазного конъюгата проводили в том же буфере с добавлением 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05 % Твина-20. В качестве хромогена использовали 0,021 % раствор АBTS (2,2-азиноди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат). Реакцию оценивали на многоканальном спектрофотометре STAR 30 Plate Reader («Ken Star», США).

Скрининг МА, обладающих вируснейтрализующей активностью к штамму Д-52 (вирус ТГС) проводили экспресс-методом РН. Равные объемы разведений гиб-ридомной жидкости, содержащей МА, и культуральной жидкости, содержащей штамм Д-52 в дозе 100-1000 ТЦД_50/мл, инкубировали в лунках пластин в течение 1,5 ч при 37 ^оС, после чего в лунки вносили по 5 ⋅ 10⁴ клеток ПТП и культивировали при 37 ^оС в СО₂-инкубаторе в течение 2-4 сут. Наличие в культуральных жидкостях гибридом вируснейтрализующих МА определяли по отсутствию цитопатического эффекта.

Для скрининга вирусспецифических МА непрямым методом ГХ ИФА использовали культуру клеток ПТП, выращенных в 96-луночных пластинах. В четных вертикальных рядах лунок культуру клеток заражали штаммом Д-52 в дозе 0,1 ТЦД50 на одну клетку, а в нечетных вертикальных рядах инфицирования не проводили. Клеточный монослой фиксировали 80 % охлажденной до –20 оС смесью ацетона и дистиллированной воды. В лунки вносили гибридомную жидкость по 0,05 см3 в разведении 1:2 (на ФБР). Пластины инкубировали в течение 1 ч при 37 оС, затем добавляли антимышиный конъюгат в рабочем разведении на ФБР-БСА по 0,1 см3 в лунку. Связавшийся конъюгат выявляли посредством добавления хромогенного субстрата (50 см3 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0; 8 мг 3-амино-9-этилкарбазола, предварительно растворенного в 3 см3 N,N-диметилформамида; 0,08 см3 33 % раствора перекиси водорода). Результаты оценивали под инвертированным микроскопом.

Препаративные количества МА выделяли из асцитической жидкости мышей линии BALB/c, которым внутрибрюшинно вводили неполный адъювант Фрейнда (0,5 см3), а через 2-7 сут — 1-2 млн гибридных клеток в 1 см3 среды ДМЕМ. Моноклональные иммуноглобулины очищали, 2-кратно высаливая сульфатом аммония при 45 % насыщении. Осадок глобулинов после второго высаливания растворяли в минимальном объеме 0,25 М раствора NaCl на 0,01 М ФБР (pH 8,0), содержащего 0,04 % азида натрия. Гельпроникающую хроматографию проводили на ультрагеле АсА-34 по рекомендациям фирмы-изготовителя. Фракции, содержащие IgG, объединяли, концентрировали высаливанием сульфатом аммония при 45 % насыщении; осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, растворяли в минимальном объеме 0,02 М ФБР (pH 7,2-7,4) и диализовали до полного удаления сульфат-ионов против требуемого буфера. Радиоиммунопреципитацию (РИП), элек- трофоретическое разделение полипептидов и иммуноблотинг проводили по методу Laemmli (9).

Наивысшие титры вируснейтрализующих антител выявлены в сыворотках крови мышей после 4-кратного введения антигена (см. табл. 1, схемы II и IV). При этом если после введения антигена в бустер-дозе внутривенно титр антител увеличивался в 2 раза, то при введении в селезенку — в 10 раз.

В результате двух процедур гибридизации нами было получено 24 клона гибридом, секретирующих МА к вирусу ТГС, у пяти из которых после 2-кратного клонирования секреция МА прекратилась. Данные по активности и стабильности секреции МА остальных 19 клонов гибридом представлены в таблице 2.

2. Оценка активности вирусспецифических моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом различными методами скрининга

Клон	Непрямой ТФ ИФА	Ингибирование ТФ ИФА	Непрямой ГХ ИФА	РН
T1G8.2, T3B9.1, T3C11.1	+	+	–	–
T1C8.3, T2D7.1	+	–	–	+
T4B11.1, T3A6.1, T1G4.2, T1C12, T4D4.1	+	+	+	–
T5H9.1, T5С11.1, T1F12.1	+	–	+	–
T2B10.1, T3H11.1, T1D9.1, T4A9.1, T4E12.1, T3E5.1	+	–	+	+

П р и м е ч е н и е: (+) и (–) — соответственно наличие и отсутствие активности.

Вторичная проверка 19 клонов, обладающих вирусспецифической секрецией, показала, что 18 из них секретировали МА, которые вступали в реакции с антигенами всех испытанных штаммов вируса ТГС и штамма ЛУК РКВС при непрямом ТФ ИФА, то есть эти моноклональные антитела обладают специфичностью к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Один клон продуцировал МА, которые реагировали с антигенами всех штаммов вируса ТГС и не вступали в реакцию с антигенами РКВС.

Каждый вид МА мы проверяли на конкурентоспособность с остальными видами за связывание с определенными эпитопами вируса ТГС (штамм Д-52). По этому признаку МА распределились на восемь групп. При этом было установлено, что МА в двух группах связывались с антигенными детерминантами, расположенными на нуклеопротеине N вируса ТГС (штамм Д-52). В четырех группах МА вступали в реакцию с антигенными детерминантами, расположенными на пепломерном гликопротеине белка Е2 вируса ТГС (штамм Д-52); МА двух клонов (Т3Е5.1 и Т3С11.1) не реагировали с антигенами вируса ТГС в иммуноблотинге. Вероятно, последние обладали специфичностью к конформационно-зависимым антигенным детерминантам, которые разрушаются в процессе подготовки антигенов для электрофоретического фракционирования (антигены подвергали кипячению и воздействию додецилсульфата натрия).

Изотип МА определяли методом ТФ ИФА с использованием набора «Calbiochem hybridoma sub-isotyping kit mouse». Семь видов МА имели изотип IgG2a, один — IgM. Активность выделенных иммуноглобулинов определяли в реакциях диффузной преципитации (РДП) и РН, непрямых вариантах ТФ ИФА и ГХ ИФА (табл. 3).

3. Оценка активности моноклональных антител, специфических к антигенам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, в иммунологических реакциях и изотип моноклональных антител (МА)

Клон	Непрямой ТФ ИФА	Непрямой ГХ ИФА	РДП	РН	Изотип МА
T1G8.2	1:10000	0	0	>1:10	IgG2а
T3B9.1	1:100000	0	0	>1:10	–
T3C11.1	1:10000	0	0	>1:10	–
T1C8.3	0	0	0	1:6250	–
T2D7.1	0	0	0	1:1250	–
T4B11.1	1:10000	1:1000	0	>1:10	–
T3A6.1	1:100000	1:1000	0	>1:10	IgG2а
T1G4.2	1:10000	1:10000	1:20	>1:10	IgG2а

T1C12	1:1000000	1:100000	0	>1:10	–
T4D4.1	1:10000	1:1000	0	>1:10	IgG2а
T5H9.1	1:100000	1:10000	0	>1:10	–
T5С11.1	1:10000	1:1000	0	>1:10	–
T1F12.1	1:100000	1:1000	0	>1:10	–
T2B10.1	1:100000	1:1000	0	1:50	IgG2а
T3H11.1	1:10000	1:1000	0	1:250	–
T1D9.1	1:100000	1:10000	0	1:50	–
T4A9.1	1:10000	1:1000	0	1:250	IgG2а
T4E12.1	1:100000	1:100000	0	1:6250	IgG2а
T3E5.1	1:1000	1:1000	0	1:50	IgМ
П р и м е ч а н и е.	Прочерк означает,	что изотип не установлен.

Итак, нами получено 19 линий гибридных клеток, стабильно секретирующих моноклональные антитела, обладающие специфичностью к структурным белкам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Эти антитела пригодны для создания моноклональных иммунореагентов и разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.     R e g u l a G., L i c h t e n s t e i g e r C.A., M a t e u s-P i n i l l a N.E. е.а. Comparison of serologic testing and slaughter evaluation for assessing the effects of subclinical infection on growth in pigs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 2000, 15, 217(6): 888-895.

• 2.     C a r m a n S., J o s e p h s o n G., M c E w e n B. е.а. F ield validation of a commercial blocking ELISA to differentiate antibody to transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine respiratory coronavirus and to identify TGEV-infected swine herds. J. Vet. Diagn. Invest., 2002, 14(2): 97-105.

• 3.    F u r u u s h i S., S y i m i s u Y. Multiplication of low and hige cell culture passagen strains TGEV in orgaans new born piglets. Vet. Microbiol., 1979, 3: 169-176.

• 4.    В о л л е р А.А., Б и д у э л л А. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. Теория и практика. Бюл. ВОЗ, 1977, 53: 38-45.

• 5.    Д з а н т и е в Б.Б., К а н а т н и к о в А.Н., П а р б у з и н В.С. Классификация и характеристика методов иммуноферментного анализа. В сб.: Методы иммуноферментного анализа в биологии и медицине. М., 1983: 37-51.

• 6.    K i m L., H a y e s J., L e w i s P. е.а. Molecular characterization and pathogenesis of transmissible gastroenteritis coronavirus and porcine respiratory coronavirus field isolates co-circulating in a swine herd. Arch. Virol., 2000, 145, 6: 1133-1147.

• 7.    K o h l e r G., M i l s t e i n C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of рredefined specificity. Nature, 1975, 256, 5517: 495-497.

• 8.   G o o d i n g J.V. Antibody production by hybridomas. J. Immun. Meth., 1980, 39, 4: 285-308.

• 9.    L a e m m l i U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature, 1970, 227: 61-67.

Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, 601120, Владимирская обл., г. Покров