Получение и применение фосфолипидов - исходного материала для изготовления липосомальных форм лекарственных препаратов

Введение. С учётом того, что традиционные способы извлечения фосфолипидов нуждаются в использовании дорогих материалов, таких как подсолнечное масло, яичный желток, а также икра кальмаров и рыбы, выход конечного продукта остаётся низким, не превышая при этом 7‑10%. Кроме того, в продукте обнаруживается значительное количество холестерина в виде примеси. Исходя из этого возникла необходимость проведения дальнейших исследований, цель которых - расширение сырьевой базы источников получения и применение фосфолипидов - исходного материала для создания липосомальных форм лекарственных средств.

Состав мембраны липосом имеет аналогию в строении и составе с эластичной белково -липидной оболочкой клеточных мембран. Это является основным терапевтическим преимуществом препаратов в липосомальной форме [1].

Анализируя литературные данные можно встретить различные способы и механизмы получения как основных компонентов липосо- мальных структур - фосфолипидов, так и непосредственно липосомальных мембран. К примеру, известен способ получения холестерина из мозга крупного рогатого скота (спинного и головного), путем экстрагирования сырья ацетоном. Однако при данном способе экстрагирования происходит многокомпонентный выход получаемого экстракта, в котором в комплексе с фосфолипидами выделяются и жирные кислоты, плазмагены и другие компоненты. И что самое важное, выход фосфолипидов колеблется в диапазоне 3-14%, что в целом недостаточно для полноценного осуществления технологического получения липосомальных структур [2].

Известна также и технология получения лецитина из желтков куриных яиц [3], которая в целом как и в предыдущем примере преду- сматривает экстракцию в ацетоне, отличающаяся температурными режимами и временем экстракции. В тоже время при данном способе выявляются определенные недостатки, связанные со значительными потерями выхода целевого продукта при недостаточно полной экс- тракции продукта.

Необходимо упомянуть и метод экстракции фосфолипидов из животной ткани по технологии Фолча [4]. Однако недостаток метода проявляется в переходе в липидный экстракт так называемых не липидных примесей, с образованием в органических растворителях мицел многих липидов, которые в свою очередь захватывают воду и различные низкомолекулярные вещества.

В значительной степени примечательным является и то, что фосфолипиды получают из икры сельди или промышленных отходов двустворчатых моллюсков, головоногих моллюсков [5, 6, 7].

В ранее изложенном было отмечено, что существует множество методов и подходов к получению фосфолипидов — ключевых компонентов липосомальных систем. Однако основные недостатки таких технологий заключаются в использовании дорогостоящего сырья, низком выходе продукта и наличии различных примесей, таких как холестерин. Эти факторы в конечном итоге ограничивают возможности применения данных технологий.

Таким образом, целью настоящих исследований стала разработка технологии получения фосфолипидов, позволяющая повысить выход готового продукта с одновременным снижением содержания сторонних примесей.

Условия, материалы и методы. Для реализации цели был разработан метод получения фосфолипидного комплекса, включающий этапы измельчения сырья, экстракцию с использованием ацетона и последующую фильтрацию. В качестве технологического сырья предлагается использовать продукт пчеловодства — подмор пчел, который является побоч- ным продуктом производства меда.

Обоснованием для использования подмора пчел в качестве технологического сырья-источника фосфолипидов, является его многокомпонентный состав: витамины, микроэлементы, аминокислоты и другое, обладающие способностью связывать и выводить токсические вещества, радиоактивные изотопы и соли тяжелых металлов – радиопротекторные и антитоксические действие), восстановить и защитить ДНК, нейромедиаторным, антитромбиновым влиянием, снижает уровень холестерина в крови, лечебно-профилактическим эффектом при стенокардии, аритмии, острого инфаркта миокарда, порогах сердца, ишемического инсульта, гемолитико-уремическом синдроме [8, 9] и другими методами его переработки, что приводит к повышению выхода и улучшению качества конечного продукта.

В качестве источника фосфолипидов использовали подмор пчел. На начальном этапе подмор пчел просеивали через сито, и затем сушили с использованием потока, нагретого до температуры 65-75 °C воздуха. Окончанием предварительного этапа служило достижение показателя влажности пчелиного подмора равное 6%. Выбор показателя влажности был обоснован тем, что при данном значении влажности достигалась наибольшая степень крошимости подмора пчел, с получением порошкообразной массы с размером частиц от 100 до 1000 мкм. Размер полученных микрочастиц способствовал увеличению площади контакта с экстрагентом.

На рисунке показаны иллюстрации технологических этапов получения фосфолипидов, а именно процессы гомогенизации и экстракции.

а) гомогенизация

б) экстракция

Рисунок - Получение фосфолипидов из пчелиного подмора

На следующем этапе работы порошкообразную массу пчелиного подмора засыпали в колбу и заливали ацетоном в соотношении сырья к растворителю 1:5. Перемешивание осуществляли на магнитной мешалке с подогревом, при температуре 30 °C в течение 60 мин. Полученную взвесь процеживали через воронку с использованием бумажного фильтра.

Супернатант удаляли и для дальнейшей работы использовали осадок, который растворяли в смеси С2Н6О, СНСl3, и СН3СООН в объёмном соотношении 25:15:4. Общий объём растворителя составлял 100 мл, при этом соотношение осадка к растворителю поддерживалось на уровне 1:5. Процесс растворения проводили при температуре -4 °C в условиях азотной среды с непрерывным перемешиванием на магнитной мешалке в течение 10 минут. Полученная смесь снова фильтровалась через воронку Бюхнера с использованием бумажного фильтра.

На последующем этапе работы к полученному фильтрату добавляли 100 мл охлажденного до минус 20 °C абсолютного ацетона. Взвесь перемешивали на магнитной мешалке. Осадок отфильтровывали и затем сушили в вакуумном эксикаторе в атмосфере азота при наличии гидроксида калия.

В полученном высушенном осадке определяли наличие фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии с применением наборов стандартов фосфолипидов в качестве референтных образцов [10].

Результаты и обсуждение. Для разработки оптимального способа получения фосфолипидов из тестируемого технологического сырья -подмора пчел, проводили сопоставительный анализ результатов путем использования различных технологических параметров проведения испытаний.

Согласно первому способу получения комплекса фосфолипидов, исходное сырье сушили в сушильном шкафу при температуре 60-82 °C на протяжении 2,0-2,5 часов, предварительно равномерно распределив по всей площади противня. Толщина слоя составляла 5-7 мм. На следующем этапе высушенный подмор пчел перетирали в лабораторной ступке и проводили экстракцию. Для этого использовали 250 г порошкообразной навески, которую помещали в круглодонную колбу. Затем навеска заливали ацетоном в соотношении 1:10 по массе и нагревали до 20 °C, обеспечивая непрерывное перемешивание магнитной мешалкой в течение 1520 минут. Фильтрацию экстракта осуществляли в воронке Бюхнера с использованием бумажного фильтра. Полученный осадок растворяли в 100 мл смеси СНСl 3, С 2 Н 6 О и СН 3 СООН в пропорциональном соотношении компонентов 20:10:2 соответственно. Растворение производили путем перемешивания на магнитной мешалке с подогревом в течение 15 мин и температуре 20 °C. Повторно проводили фильтрацию экстракта в воронке Бюхнера с использованием бумажного фильтра. Затем с использованием эксикатора путем упаривания проводили выделение фосфолипидов. Выход фосфолипидов составил 6-8% от исходной массы подмора.

Во втором способе исходное сырье - пчелиный подмор засыпали в мешочки из хлопчатобумажной ткани. Затем мешочки размещали на металлической сетке таким образом, чтобы тол- щина слоя исходного сырья в мешочке составляла 2-4 см. После этого на сетку направляли поток нагретого до температуры 70-75 °C воздуха и проводили сушку в течение 20-40 мин. Окончание сушки определяли путем ручного растирания сырья. При этом должна была достигаться значительная степень крошимости. Показатель влажности соответствовал значениям в диапазоне 5-7%.

Измельчение сырья, процесс экстракции, фильтрацию, а также перерастворение фильтрата проводили согласно первому вышеописанному способу получения фосфолипидов, с той лишь разницей, что в процессе перерастворения фильтрата использовали экспериментальное соотношение растворителей СНСl 3 _, С₂Н 6 О и СН 3 СООН - 22:13:3 соответственно. Выход фосфолипидов в этом случае составлял 10-12% от исходной массы подмора.

Нами предложен (разработан) третий способ получения комплекса фосфолипидов, который включает в себя получение и высушивание исходного сырья - пчелиный подмор по второму вышеописанному способу. Высушенную массу измельчали до порошкообразного состояния с размером частиц от 100 - 1000 мкм. Это способствовало увеличению площади активной поверхности сырья, что в свою очередь обеспечивало максимально эффективную обработку соответствующими экстрагентами. Для этого измельченное сырье заливали ацетоном и перемешивали на магнитной мешалке с подогревом в течение 60 мин при температуре 30 °C.

Затем проводили фильтрацию экстракта согласно вышеуказанным первому и второму способам. В последующем фильтрат перерас-творяли в смеси СНСl 3, С 2 Н 6 О и СН 3 СООН с пропорциональным соотношением компонентов - 25:15:4. Повторно проводили фильтрацию. Выделение фосфолипидов осуществляли путем выпаривания фильтрата в вакуумном эксикаторе при потоке азота над гидроксидом калия. При использовании данного метода выход фосфолипидов составлял 17,0-18,0% от первоначальной массы пчелиного подмора. При этом доля фосфатидилэтаноламина составляла 27,0% от общей массы, фосфатидилхолина – 28,0%, сфингомиелина – 17,0%, фосфатидилинозита – 15,0%, а фосфатидилазина - 15,0%.

Сравнительный анализ показателей предлагаемого (третий способ) и известного способов получения фософолипидов представлен в таблице.

Таблица - Сравнительный анализ технологических показателей предлагаемого и известного способов получения фосфолипидов

Наименование показателей	Методы
	известный	предлагаемый
Выход фосфолипидов, % к массе сырья	7,5-8,0	17,0-18,0
Фракционный состав фосфолипидов в целевом продукте, %
Фосфатидилэтаноламин	18,0	27,0
Фосфатидилсерин	-	15,0
Фосфатидилинозит	не установлено	15,0
Фосфатидилхолин	74,0	28,0
Сфингомиелин	7,5	17,0
Другие примеси	-	отсутствуют
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОЙ АКАДЕМИИ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМ. Н.Э. БАУМАНА | Том 265(1) | 2026

При этом данные по известным способам (1 и 2 способам) представлены только исходя из результатов второго способа получения фосфолипидов. Исходили из того, что при втором способе результаты по выходу готового продукта были более значительными (10-12% в сравнении с первым способом 68%).

Из таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет в 2,5 раза повысить выход целевого продукта и оптимизировать эквимолярные соотношения фракций фосфолипидов, которые обеспечивают высокую степень родства к клеткам органов-мишеней макроорганизма.

Выводы. Разработанный способ получения фосфолипидов обладает рядом преимуществ, основанных на следующем: сочетание процессов предварительного высокоэффективного обезвоживания основного сырья апипро-дукта - пчелиного подмора с последующим экстрагированием ацетоном при определенных значениях температурного режима, позво- ляет обеспечить проведение однократной экстракции с параллельной очисткой фосфолипидов от полипептидных примесей. В тоже время в результате проведенных исследований удалось сократить продолжительность процесса экстракции, путем комплексного экспериментального подбора оптимального соотношения растворителей СНСl3, С2Н6О, и СН3СООН, параметров температурного режима и скорости перемешивания. И очень важно отметить применение тока азота в предлагаемом способе получения фосфолипидов, который способствовал повышению их технологического выхода.

Подводя итоги необходимо отметить, что в результате проведенных исследований был разработан высокоэффективный и технологичный способ получения фосфолипидов из апипродукта - пчелиного подмора, который может быть интегрирован в общую технологическую цепочку фармацевтического производства липосомальных форм лекарственных препаратов.