Получение комплесных добовок на основе D-маннита (Е 421) для повышения биодоступности азотистых оснований

Широкое распространение молекулярных комплексов как композитных составов в настоящее время получило благодаря таким важным свойствам, как повышение биодоступности и стабильности и улучшение показателей растворимости. Наиболее структурно, соответ- ствующими компонентами для синтеза молекулярных комплексов являются полифункцио-нальные органические соединения, одними из которых являются многоатомные спирты, в частности, D-маннит [1] - инъекционный медицинский препарат, пищевой диспергатор и низкокалорийный подсластитель – добавка Е 421. Последнее обусловливает активное исследование молекулярных комплексов маннита как ценных продуктов для пищевой и фармацевтической промышленности.

Поведение D -маннита в присутствии азотистых оснований пуринового ряда в последнее десятилетие является предметом всестороннего изучения. В частности, авторами [2] исследована сокристаллизация D -маннита с теофиллином для разработки потенциально биоактивной фармсубстанции (ингаляционный препарат), при этом показано, что совместное диспергирование компонентов приводит к образованию гомогенной лекарственной формы. Для пищевых систем важным аспектом является изучение поведения компонентов в дисперсных системах; исследования в растворах, содержащих D- маннит и нуклеиновые кислоты, показали [3], что взаимодействие реализуется посредством образования водородных связей между ОН-группами полиола и N-центрами азотистых оснований. Детализация строения продуктов конъюгации выполняется методами термического анализа и молекулярной спектроскопии [4].

Еще одной общей проблемой технологии биологически активных веществ в литературе упоминается изучение химии криопротекторов и составов криоконсервации [5], определенное практическое значение в разработке которых также имеет система «D- маннит - аденин». В последнем случае важным моментом является возможность протекания быстрых равновесий в растворах азотсодержащих веществ, а также наличие нескольких реакционных центров, в том числе стереоизомерных [6]. В этом случае преимущество может иметь гетерогенный синтез молекулярных комплексов в неводных средах [2], который, кроме того, обеспечивает сохранение структурной модификации компонентов в случае проявления полиморфизма.

В связи с этим основной проблемой исследований структурообразования в описанных выше системах является возможность присутствия в растворах различных по степени протонирования форм аденина [7]. Такими соединениями могут быть солеобразные производные, содержащие в качестве катиона комплексную частицу, включающую как протонированную, так и депротонированную форму аденина [8]; подобные вещества достаточно хорошо изучены, в частности, описаны методы их синтеза [9]. Проведение синтеза с использованием подобного реагента позволит реализовать конкуренцию реакционных центров аденина и сделать выводы относительно структуры полученных комплексов и общих закономерностей поведения системы.

Цель работы – получение и исследование строения комплексной добавки в двойной системе D- маннит - аденин, потенциально активной в отношении повышенной динамики растворения, обеспечивающей высокую скорость высвобождения азотистого основания.

Материалы и методы исследования

Получение частично депротонированной формы аденина (адениний-аденин гидросульфата, Ade) проводили путем перемешивания водного раствора, содержащего 0,05 г аденина сернокислого (AdeH) и карбоната натрия при температуре 25 ± 2 ° С до окончания выделения СО 2 . Осадок отфильтровывали, после чего промывали водой и высушивали в эксикаторе в течение нескольких дней (выход: 0,03 г).

Для синтеза молекулярного комплекса в спиртовой среде [2] в 20 см³ этанола (96 %, Merck) вносили по 0,001 моль аденина (Ade) и D- маннита (Man) (ч.д.а.), после чего смесь при непрерывном перемешивании нагревали в колбах с обратным холодильником с использованием модуля роторного испарителя ИР-1М3 в течение полутора часов при температуре 40 ° С, поддерживая равномерное нагревание. По окончании синтеза избыток растворителя удаляли, твердую фазу высушивали в эксикаторе (выход: 0,03 г).

Колебательные спектры выделенных твердых фаз регистрировали на ИК-Фурье спектрометре ФСМ-2201 (ООО «Инфраспек», СПб., Россия) в интервале волновых чисел 50

4000 - 400 см^-1 с разрешением по волновому числу 4 см^-1 при 40 сканах в таблетках KBr (1:250), полученные спектры обрабатывали в программе FSpec 4.2.0.9 [10].

Эксперименты по растворению синтезированного молекулярного комплекса в сравнении с аденин-сульфатом проводили согласно [11], процессы проводили с пробами твердых фаз массой 10 мг при температуре 25±2 ° С при непрерывном перемешивании (100 об/мин) в 90 см 3 дистиллированной воды. Контролировали оптическую плотность ( l = 1 см) при длине волны 260 нм (спектрофотометр СФ-2000, ОКБ «Спектр», СПб., Россия) отбором проб через 15, 30 и 45 мин после начала эксперимента, для чего отбирали пробы 10 см³ (восполняя отобранный объем чистым растворителем), по значениям которой определяли процент высвобожденного при растворении азотистого основания.

Результаты исследования и их обсуждение

Первым этапом работы являлся синтез и идентификация производного аденина, в составе которого присутствуют протонированная и депротонированная формы последнего, в частности гидросульфата адениния-аденина (Ade).

Присоединение протона к молекуле аденина может происходить по нескольким реакционным центрам, наиболее вероятным молекулярным центром присоединения протона является N1-атом пиримидинового кольца [12, 13], что подтверждается наличием полосы 1190 см^-1 в спектре сульфата аденина (рис. 1, табл. 1), характерной, по литературным данным, для протонированной формы [12]. Как следствие, сигнал 1700 см^-1 в спектре AdeH-формы может быть отнесен к характерной для = N 1- H-таутомера имино-форме С = NH 2 ⁺ (νС 6 = NH 2 ).

Таблица 1

Отнесения полос в колебательных спектрах исследуемых компонентов [1, 12, 13]

Ade		AdeH		Man
ν, см-1	Отнесение	ν, см-1	Отнесение	ν, см-1	Отнесение
1709	ν С=NH+, δ NH2	1700	ν C6=NН2	1630	δ HOH
1670	δs NH2 (in plane)	–	–	1418	δ C2-OH
1607	ν C=N , ν C=C	1612	ν C=N , ν C=C	1283	δ HCO, τ СН2
1510	δ C-N9-H	1574	ν C=N , ν C=C , δ СН	1260	δ HCO
1474	ν С=С , δ СН	1476	ν С=С , δ СН	1211	δ HCO
1418	ν N=CH , δ N9H	1425	ν N=CH , δ N9H	1082	ν CC, ν C2-O
1335	ν C-N	1344	ν C-N	1020	ν C1-O
1310	ν C-N , ν C-NH2	1315	ν C-N , δ NH имид	960	δasССО
1248	ν C-N , δas NH2	1225	ν C-N	930	δs ССО
–	–	1190	δ NH пиримидин	883	ν CC
1120*	δ NC , δ CH	1130*	δ NC , δ CH	864	δ CC
1026	δ C-N-C , ρ NH2	1026	δ C-N-C , ρ NH2	785	τ HCC
974	ν C-C	974	ν C-C	704	τ HOC
940	δ N-C=N	955	δ N-C=N	630	τ HOC
912	ν C-C , γ N9-H	900	ν C-C , γ N9-H	586	γ OCC , δ OCC
797	γ C6-цикл	802	γ C6-цикл	515	τ HOCC
642	ρ СН	777	τ C6, τ C5 (цикл)	–	–

*маскируются поглощением сульфатов

Добавление к раствору сульфата аденина рассчитанного количества карбоната натрия приводило к образованию производного, характеризующегося в спектре твердой фазы наличием полосы 1670 см^-1 (δ^sNH 2 ), характерной для депротонированной NH 2 (C 6 )-группы, а также сигналом 1709 см^-1, относимым, вероятно, к сложным колебаниям иминиевого С=NH⁺-фраг-мента пиримидинового цикла и С 6 -NH 2 -молекулярной группы:

При этом происходило изменение таутомерного состояния протонированной формы в

соответствии с равновесием, смещающимся влево:

Рисунок 1 – Колебательные спектры сульфата аденина и гидросульфата адениния-аденина: 1 – Ade; 2 – AdeH

Таким образом, полученный продукт являлся гидросульфатом адениния-аденина, аналогичная структура в форме перхлората была ранее описана авторами [8]. Другие характеристические сигналы в спектрах обоих типов структур отвечали 9-Н-форме (полосы 1510, 14181425, 900-910 см^-1) имидазольного фрагмента аденина [12, 13], что соответствовало максимальной основности N 9 -центра.

Вторым этапом работы являлся синтез молекулярного комплекса в системе Ade – Man, строение которого подтверждалось сопоставлением колебательных спектров исходных компонентов и полученного продукта (рис. 2).

Анализ данных таблицы 1 в совокупности с рисунком 2 показал участие аминогруппы депротонированной формы аденина в конъюгации с маннитом: полосы 1709 и 1670 см-1 в спектре Ade нивелировался и в спектре комплекса регистрировался сигнал 1695 см-1. Можно предположить, что высокочастотное смещение 1670→1695 см-1 отвечало частичному переносу атома водорода ОН-групп маннита на атом азота NH2-группы посредством образования прочной Н-связи [14, 15]. Дополнительная интенсивность полосе 1190 см-1 в спектре комплекса также придается, вероятно, образованием Н···NH2 и =N-H пиримидинового цикла; кроме того, данный эффект был характерен для межмолекулярно-связанных углеводных спиртов [16]. С другой стороны, наблюдается подавление интенсивных полос валентных С-О-колебаний маннита (1082 и отчасти 1020 см-1) вторичных и первичных ОН-групп, что обычно бывает при комплексообразовании молекул полиолов [16]. Менее определенным является ответ на вопрос относительно природы ОН-групп маннита, участвующих в образовании комплексов c аденином; наиболее вероятным представляется участие вторичных ОН-групп, о чем свидетельствуют:

• -    практически полное подавление интенсивности полосы 1082 см^-1, относимой к ν C2-O маннита (табл. 1), тогда как полоса 1020 см^-1 (ν C1-O ), несколько смещаясь к значениям 1024 см^-1, остается достаточно интенсивной; данный эффект, вероятно, характерен для всего класса многоатомных спиртов при их конъюгации c азотсодержащими производными [17];

• -    интенсивная полоса 1283 см^-1 в спектре маннита, относимая к крутильным колебаниям СН 2 , претерпевает высокочастотное смещение к значениям 1314 см^-1, свидетельствующее об отсутствии комплексообразования с участием СН 2 ОН [18], при этом авторами [19] показано, что описанное смещение полос СН 2 отвечает образованию внутримолекулярных Н-связей.

Рисунок 2 – Колебательные спектры исходных компонентов и продукта синтеза: 1 – Man; 2 – Man-Ade; 3 – Ade

Таким образом, схема образования молекулярного комплекса в исследуемой системе может быть представлена в следующем виде:

Следует отметить, что предложенный подход, основанный на осаждении молекулярного комплекса из этанольной среды, имел определенные преимущества перед описанными в литературе методами, в том числе основанными на термических подходах [11, 16], которые могут приводить к более глубокому структурообразованию.

Третьим этапом настоящего исследования являлось изучение растворимости полученного комплекса в сопоставлении с сульфатом аденина [11]: результаты тестов на растворение свидетельствовали о свойствах препаратов, влияющих на их биодоступность.

Электронные спектры полностью протонированной и частично депротонированной форм аденина представлены на рисунке 3; поглощение обеих форм при 250–260 нм (π→π*-переход) было практически одинаково, что дало возможность сравнивать количество перешедшего в раствор вещества при растворении твердой фазы по значениям А 260 .

Рисунок 3 – Электронные спектры субстанций различных форм аденина: 1 – AdeH; 2 – Ade (0,01%-ные водные растворы)

Данные по динамике растворения AdeH и Ade-Man представлены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика (%) высвобождения аденина из твердых фаз AdeH и Man-Ade при растворении в течение заданного времени

Твердая фаза	15 мин	30 мин	45 мин
AdeH	2,2	4,7	12,6
Man-Ade	4,8	6,9	15,9

Анализ данных таблицы 2 показал достаточное превышение показателей высвобождения при растворении комплекса, что может быть обусловлено модифицированием сравнительно гидрофобной структуры аденина гидрофильными молекулами D- маннита [11].

Полученные данные перспективны при изучении функционализации D- маннитом содержащих фрагменты азотистых оснований нуклеиновых кислот [3], которые демонстрируют противовирусную активность в отношении широкого спектра штаммов. Актуальным представляется также исследование антиокислительных защитных функций [20], проявляемых маннитом в комплексах с азотсодержащими гетероциклами биополимеров в процессе защиты ферментов пищевых систем от инактивации [21].

Заключение

Результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы:

• 1.    Выполнен синтез молекулярного комплекса D- маннита ( Е 421 ) с аденином с применением частично депротонированной формы аденина (гидросульфата адениния-аденина), полученного предварительно.

• 2.    Исследование строения комплекса показало участие свободной аминогруппы в связывании со вторичными гидроксильными группами маннита посредством водородных связей, вероятно, с частичным переносом протона гидроксогрупп.

• 3.    Выделение молекулярного комплекса из спиртового раствора предпочтительнее подходов, основанных на термических методах синтеза, поскольку позволяет избежать значительных структурных превращений как исходных компонентов, так и продукта их взаимодействия.

• 4.    Изучение динамики растворения комплекса в сравнении с аденином показывает заметное увеличение высвобождения азотистого основания в первом случае, что, вероятно, обусловлено модифицированием сравнительно гидрофобной структуры аденина гидрофильными молекулами D- маннита.