Получение тромбоцитов человека в условиях ex vivo

"Введение. Технологии с использованием стволовых клеток в настоящее время развиваются быстрыми темпами. Некоторые из них уже проходят клинические испытания в области регенеративной медицины, разработаны стратеги для лечения рефрактерного язвенного колита, инфаркта миокарда, гепатокарциномы, коленного остео-артрита¹, заболеваний печени с использованием стволовых клеток², восстановления зубов³. В то же время использование стволовых клеток для получения тромбоцитов может восполнить растущую необходимость в них в клинике.

В РФ состояние донорства компонентов крови является достаточно сложным. По данным на 2011 г. показатель числа доноров на 1000 человек населения в среднем по России не превышал 13,5,

Ключников Дмитрий Юрьевич , биолог.

в то время как по Европе достигал 40. Важно отметить, что кроме традиционного использования компонентов крови в хирургической, акушерской, педиатрической, онкологической и гематологической практике, в последние годы развивается необходимость в обеспечении высокотехнологичных медицинских методов лечения, таких, как, например, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, часто сопровождающейся тяжелыми тромбоцитопениями вследствие перенесенной высокодозной химиотерапии4. Эти методы все шире внедряются в практику, что также сопряжено с увеличением потребности в донорской крови и ее компонентах, в том числе и тромбоцитах5.

Возможность получения тромбоцитов человека из стволовых клеток для клинического применения в связи с этим вызывает большой интерес, особенно в последние годы. Первые успехи в получении тромбоцитов из стволовых клеток пупо- винной крови были достигнуты еще 8 лет назад6, и несмотря на то, что количество тромбоцитов и их выход оказался недостаточным для применения для клинических целей, была доказана сама принципиальная возможность разработки подобной технологии. Создание условий для высокоэффективного получения тромбоцитов человека является главной задачей в этой области на сегодняшний день. И для ее решения требуется более полное понимание самих процессов экспансии ГСК, дифференцировки в мегакариоциты, их созревания, а также образования протромбоцитов и высвобождение тромбоцитов.

Созревание мегакариоцитов. В процессе своего созревания ГСК дифференцируются в общие миелоидные предшественники (ОМП) и бипотенциальные мегакариоцитарно-эритроидные предшественники (МЭП), которые дают начало как мегакариоцитарной, так и эритроцитарной линии в костном мозге. Регуляция дальнейшего пути дифференцировки МЭП определяется множеством транскриптационных факторов, включая Runx1, Gata1, Fli1 и c-Myb. Экспрессия c-Myb в МЭП предполагает их дифференцировку в эритроцитарную линию, и наоборот его экспрессия подавляется при дифференцировке в мегакарио-цитарную. Gata1 и его ко-фактор Fog1 играют важные роли в процессе дифференцировки в ме-гакариоцитарно-эритроидном направлении, в то же самое время ингибируя экспрессию Pu.1 и миелоидную дифференцировку. Действие Runx1 опосредовано через Gata1 и Fli1, чьи сайты связывания могут быть обнаружены в энхансерах многих специфичных для мегакариоцитов генах. При этом Fli1 увеличивает активность Gata1 в промоторах мегакариоцитов и угнетает активность эритроидных факторов в эритроидных промоторах⁷.

Следует отметить, что одним из важнейших агентов в процессе мегакариоцитопоэза является тромбопоэтин (ТПО). ТПО (также известный как c-Mlp лиганд) – гликопротеин, который взаимодействует с c-Mpl рецептором, стимулируя пролиферацию и созревание мегакариоцитов, а так- же он играет важную роль в поддержании и пролиферации ГСК8.

Сам процесс созревания мегакариоцитов начинается в остеобластной нише стволовых клеток. В процессе созревания мегакариоциты покидают нишу стволовых клеток посредством негативной регуляции поверхностных рецепторов и попадают в периваскулярную нишу. Интересно, что ниша стволовых клеток и периваскулярная ниша могут и не быть физически разделены. Предполагается, что изменяются взаимодействия мегакариоцитов и ниши. Отличительными признаками созревания мегакариоцитов являются эндорепликация (полиплоидизация) и увеличение массы цитоплазмы. Размер зрелых мегакариоцитов увеличивается до 100 – 150 мкм в диаметре (это самые крупные крупные гемопоэтические клетки в костном мозге), а плоидность до 128N. Следует отметить, что существует корреляция между уровнем плоидности и количеством образующихся тромбоцитов9.

Образование тромбоцитов. До недавнего времени существовало две модели объясняющие процесс образования тромбоцитов из мегакариоцитов. В фрагментационной модели, мегакариоциты мигрируют из костного мозга в легкие, где в микроциркуляционных частях сосудистого русла разламываются на тромбоциты. В альтернативной модели, которая на сегодняшний день подтверждена экспериментально, мегакариоциты образуют огромное количество ветвей (протромбоцитов) внутри сунусоидов костного мозга, которые высвовобождают тромбоциты в кровяное русло¹⁰.

Протромбоциты образуются из выростов цитоплазмы мегакариоцитов, оканчивающихся выпуклостями размером с тромбоцит. А сами мембраны протромбоицтов образуются из системы демаркационных мембран, которые являются огромным впячиванием мембраны мегакариоцита на всем протяжении ее поверхности. Протяженность системы демаркационных мембран коррелирует с количеством протромбоцитов образующихся с мегакариоцита. Микротрубочки запускают элонгацию, а актин и миозин содействуют транспорту органелл по стволу протромбоцитов для формирования тромбоцитов, в это время актин запускает еще и ветвление протромбоцитов.

Предполагается, что ветвление увеличивает количество тромбоцитов образуемое мегакариоци-том11. Зрелость мегакариоцитов и уровень поли-плоидизации играют важную роль в количестве образованных тромбоцитов на клетку. Микроокружение периваскулярной ниши обеспечивает внешние стимулы, включая фибронектин, фибриноген и Фактор фон Виллебранда, необходимые для индукции тромбоцитообразования. Однако конечный триггер заставляющий мегакариоциты образовывать протромбоциты не известен. Несмотря не то, что связь протромбоцтооб-разования и апоптоза пока не ясна, апоптоз также может играть в этом процессе важную роль.

Еще одним важным компонентом в конечном образовании тромбоцитов является механическое раздражение внутри синусоидальных сосудов костного мозга. Оно может индуцировать цитоплазматическую элонгацию и отделение тромбоцитов, совместно с белками внеклеточного мат-рикса12. Существуют работы, демонстрирующие возможность размножения тромбоцитов in vitro. Эти исследования показывают возможность размножения тромбоцитов человека при условии помещения их с суспендирующую среду аутоплазмы и специальных сред13. Несмотря на то, что данные исследования требуют подтверждения, подобные работы также могут приблизить к реальности возможность ex vivo получения тромбоцитов человека для клинического применения.

Источники стволовых клеток. Существует несколько источников стволовых клеток, которые могут быть использованы для получения тромбоцитов в культуре. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки в отношении количества клеток, функциональности конечного продукта и регламентирующих отношений. ГСК (номинально CD34+), возможно, технологически самый простой материал для получения тромбоцитов. Они могут быть выделены из пуповинной и перифе-рическиой крови, а также из костного мозга.

Несмотря на то, в единице пуповинной крови (ЕПК) содержится наименьшее по сравнению с другими источниками ГСК, именно этот источник является наиболее популярным. К примеру, одна ЕПК содержит порядка 1х106 ГСК, в то время как одна доза тромбоцитов, полученная при аферезе, содержит минимум 3х1011 тромбоцитов. Таким образом, для того чтобы получить одну дозу тромбоцитов ex vivo необходима 3х105-тикратная экспансия. Каждый мегакариоцит в костном мозге способен образовывать минимум 1х103 тромбоцитов, и для получения эквивалентного количества тромбоцитов требуется 3х108 мегакариоцитов в костном мозге. Таким образом, 1х106 ГСК из одной ЕПК потребуется дифференцировать в 3х108 полностью зрелых мегакариоцитов, которые должны будут образовать 3х1011 тромбоцитов для получения всего одной дозы тромбоцитов14. Наращивание общего количества ГСК перед дифференцировкой в мегакариоциты преследует цель повысить их конечный выход. Были разработаны некоторые подходы для увеличения количества гемопоэтических прогениторных клеток более, чем в 100 раз, первоначально связанные с использованием пуповинной крови для снижения время приживления15.

Достигнутые успехи. Технологии по получению тромбоцитов в условиях ex vivo активно развиваются по всему миру. Большинство из них основано на использовании в качестве индукторов цитокинов, таких как ТПО, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-11, фактор стволовых клеток, гомолога фактора стволовых клеток и колониестимулирующего фактора 1 – Flt3 лиганда, а также некоторых других цитокинов (например, пегилированного рекомбинантного фактора роста мегакариоцитов – PEG-rHuMGDF и ингибитора семейства киназ Src – SU6656) и добавок. В некоторых стратегиях прибегают к использованию некоторых микроРНК, которые в норме высоко экспрессируются в мегакариоцитах, для увеличения эффективности образования тромбоцитов ex vivo16. Было доказано, что miR-125b и miR-660 позитивно влияют на выход мегакариоцитов и тромбоцитов в культуре. Кроме того, существуют работы, в которых ГСК культивируются совместно со стромальными клетками, которые предположительно и должны обеспечивать необходимые для дифференцировки сигналы.

В большинстве работ по культивированию мегакариоцитов из ГСК не используют сыворотку, а заменяют ее цитокиновыми коктейлями или, например, такими заменителями как смесь бычьего сывороточного альбумина, инсулина и трансферина для того, чтобы точно знать состав культуральной среды. Разрабатываемые подходы часто состоят из нескольких этапов культивирования, на первом из которых для увеличения конечного выхода мегакариоцитов и тромбоцитов предусматривается экспансия самих ГСК. В среднем продолжительность всего культивирования составляет около 14 суток в однофазных протоколах и 14 – 21 в двух- и трехфазных. Сводные данные по некоторым работам по получению мегакариоцитов и тромбоцитов в условиях ex vivo приведены в таблице.

Таб.1. Анализ источников по получению тромбоцитов человека из ГСК

о си § О S	w о Ph о u си о с S	Добавки и количество этапов			5S Л S а С	о CU	Выход тром боци ци-тов на ини-ци-аль-ную CD34 + клетку	s
		1	2	3
Аферез, CD34+	Да	10% апластичной собачьей сывовротки, 8 – 12 дней	10%  huAB плазма, 2 – 3 дня	-	11 – 15	-	-	[17]
Аферез и КМ, CD34+	Нет	IL-3, PEG-rHuMGDF	-	-	11 – 14	18	300*	[17]
ПК, CD34+	Нет	SCF, IL-3, TPO, 7 дней	ТПО, 14 дней	-	21	-	-	[17]
ПК, CD34+	Нет	IL-6, SCF, FL, TPO; 7 дней	IL-6,    SCF, FL, TPO; 10 дней	-	17	135	142**	[17]
Аферез, CD34+	Да	IL-1β, IL-6, SCF, TPO;	-	-	21	-	-	[17]
КМ, CD34+/CD 38low	Нет	IL-3, IL-6, SCF, TPO; 10 дней	TPO, SU6656; 6 дней	-	16	-	-	[17]
ПК, CD34+	Нет	Сокультивирование    с hTERT + SCF, TPO, FL; 14 дней	Сокульти-вирование с hTERT   + SCF,   TPO, FL, IL-11; 14 дней	SCF, TPO, FL, IL-11; 5 дней	33	500	42000 ***	[17]
ПК, CD34+	Да	SCF, TPO, FL, IL-6; 2 – 3 дня	TPO, FL; 7 дней	TPO, SCF, IL-6, IL-9, SU6656; >11 дней	>21	-	20*	[17]
ПК, CD34+	Нет	SCF, TPO, IL-6, IL-9	-	-	14	-	-	[18]
ПК, CD34+	Нет	SCF, TPO, IL-6, IL-9/ TPO, FLT-3, SCF; 14/4 дня	-/ SCF, TPO, IL-6, IL-9; 10 дней	-	12 – 16	-	-	[19]

ПК, CD34+	Нет	SCF, TPO, IL-6, IL-9	-	-	14			[20]
ПК, CD34+	Нет	TPO, SCF, IL-6, IL-9 / TPO, SCF, FL, IL-6, IL-3, G-SCF / TPO, SCF, Fl / TPO, SCF, FL, IL-6 / TPO, IL-3, FL, IL-6 / SCF, IL-3, FL, IL-6; 4 дня	SCF,   TPO, IL-6, IL-9; 10 – 14 дней	-	14 – 18	-	-	[21]
Аферез, CD34+	Нет	TPO, SCF, IL-3, IL-6, IL-11; 5 дней	TPO,   SCF, IL-3,    IL-6, IL-11; 2 дня	TPO, SCF, IL-3, IL-6, IL-11; 6 дней	13	-	-	[22]
ПК    и Аферез, CD34+	Нет	TPO, IL-3, протеогликаны, выделенные из голов лосося и хряща носовых перегородок китов Брай-да	-	-	14	520	-	[23]

*CD41a+/CD41a-, **Количество тромбоцитов, активированных тромбином, *** CD41a+/CD42b+

Большой интерес вызывают недавние работы по получению тромбоцитов в биореакторах. Группа ученых под руководством Cedric Ghevaert разрабытывает технологии по культивированию стволовых клеток на трехмерных подложках (частицах) в биореакторах для увеличения эффективности технологии. Проводятся работы по культивированию мегакариоцитов в ячейках чиповых 2-х поточных биореакторов, в которых мегакариоциты зафиксированы и не могут покинуть свои ниши, но образуемы ими тромбоциты вымываются потоком среды.

При этом, как показывают результаты, количество полученных тромбоцитов получается больше, чем в стационарных системах примерно в 1,5 – 3,8 раза17. Следует отметить работу по использованию микроструйного биореактора из инертного полидиметилсилоксана с имитацией эндотелия и сосудистого канала. Мегакариоциты не могли пройти через отверстия в стенках искусственного эндотелия, в то время как протромбоциты могли и превращались в тромбоциты уже в русле имитирующем сосудистый кровоток. В этом биореакторе один мегакариоцит образовывал примерно 30 тромбоцитов18.

Трудности и ограничения технологии. Одной из больших трудностей, с которыми сталкиваются все без исключения предложенные подходы к получению тромбоцитов в культуре, является меньшая эффективность созревания мегакарио- цитов и образование тромбоцитов. Полученные из стволовых клеток мегакариоциты обладают более низким уровнем полиплоидизации, и образуют, в конечном счете, количество тромбоцитов соизмеримое с мегакариоцитами периферической крови. А количество образуемых тромбоцитов напрямую зависит от уровня полиплоиди-зации мегакариоцита19. Пока неясно связано ли это с незрелостью гемопоэтического прогени-торного компартмента или самопрограмирова-нию мегакариоцитов.

В процессе полиплоидизации участвуют несколько метаболических путей. Первый, сигнальный миозиновый путь, который требуется для формирования борозды дробления и сократительного кольца (внутриклеточного комплекса, образованного нитями актина и миозинов) в течение последних этапов цитокинеза. Ингибирование активности миозина во время клеточного деления позволяет мегакариоцитам реплицировать ДНК. Путь ROCK действует через MYLK3 и филамин и активирует как образование тоно-фибрилл, так и ламелоподий. Ингибирование этого пути снижает миозиновую активацию и препятствует образованию сократительного кольца, что в целом заставляет мегакариоциты подвергаться эндомитозу. Доказано, что при определенных условиях культивирования ГСК на коллагеновых подложках, препятствующих митозу посредством нарушения образования борозды дробления при ингибировании путя ROCK (ингибирование миозина-II с помощью блебби-статина) приводит к увеличению количества ме- гакариоцитов с высоким уровнем полиплоиди-зации сопоставимым с уровнем мегакариоцитов костного мозга в 3-10, а также к увеличению образованных тромбоцитов20. Второй метаболический путь, который играет большую роль в процессе полиплоидизации мегакариоцитов, это путь с участием гена TP53, чья активность увеличивает синтез ДНК и полиплоидизацию. Культивирование ГСК с ингибитором ROCK и никотинамидом увеличивало плоидность и образование тромбоцитов еще больше. Также было показано, что киназы семейства Src ингибируют пролиферацию и дифференцировку мегакариоцитов. Соответственно, ингибирование этих киназ увеличивает полиплоидизацию мегакариоцитов и образование протромбоцитов, что продемонстрировано на линиях лейкемических клеток через путь Lyn / Fyn, а также ингибирование актиновой полимеризации21. Еще одним важным моментом является тот факт, что лишь небольшой процент мегакариоцитов, выращенных в культуре в действительности дает тромбоциты. В культуре обнаруживаются мегакариоциты с высокой степенью полиплоидизации, которые тем не менее не образуют протромбоциты.

Образование протромбоцитов у человека регулируется при участии белков внеклеточного матрикса. Мегакариоциты в нише стволовых клеток костного мозга ингибируются от образования протромбоцитов через взаимодействие с коллагеном I через GPVI и α6β1 рецептор интег-рина. Фибронектин 1 также играет роль на ранних этапах созревания мегакариоцитов в нишах стволовых клеток. Созревая, мегакариоциты покидают нишу стволовых клеток, следуя сигналам из периваскулярной ниши, в частности CXCL12. Так в периваскулярной нише мегакариоциты взаимодействуют с компонентами внеклеточного матрикса в частности с фактором Фон-Виллебрандта и фибриногеном через GPIb-IX-V и αIIbβ3 интегрин. Окружение периваскулярной ниши стимулирует образование протромбоцитов, возможно с помощью активации микротрубочек. Было обнаружено, что существует большая разница в образовании протромбоцитов в ответ на каждый белок внеклеточного матрикса, что говорит о комплексности системы22.

Важнейшим вопросом остается вопрос о функциональности выращенных в культуре тромбоцитов. Как известно, тромбоциты играют важные роли в восстановлении стенок сосудов, процессе воспаления и др., и пока неясно какие из этих нормальных функций способны осуществить выращенные в культуре тромбоциты, а также насколько они все необходимы для полученных тромбоцитов. Около 60% полученных в культуре тромбоцитов экспрессируют CD62P в присутствии агонистов тромбина и АДФ23. Есть данные о том, что большое количество полученных ex vivo тромбоцитов уже находятся в полу-активированном состоянии даже в отсутствии тромбина24. Способность выращенных в культуре тромбоцитов человека к образованию сгустка можно узнать с помощью стандартной агрего-метрии, однако для тестирования требуется слишком большое количество тромбоцитов.

Заключение. На пути к получению тромбоцитов в условиях ex vivo проделано уже немало работы, и эта тема продолжает очень активно изучаться в мире. Становится очевидным, что прогресс в этом направлении сделает тромбоциты, выращенные в культуре, реальным источником для клинического применения. Но, несмотря на такое бурное развитие на пути к получению достаточного для этого количества тромбоцитов человека стоит немало трудностей и нерешенных вопросов. Чтобы воплотить в жизнь подобную технологию требуется более точно изучить механизмы регуляции мегакариоцитопоэза: какие взаимодействия с нишей необходимы для созревания мегакариоцитов, какие и как именно метаболические пути участвуют в полиплоиди-зации, как, воздействуя через системы цитоскелета увеличить плоидность мегакариоцитов, какие белки внеклеточного матрикса индуцируют образование протромбоцитов, какие транскрип-тационные факторы могут быть использованы, и, наконец, способны ли тромбоциты к делению. Кроме того важным остается и вопрос о выборе материала и увеличении (наращивании) ГСК.

Ответы на все эти вопросы помогут увеличить эффективность получения тромбоцитов ex vivo. С другой стороны производство тромбоцитов должно быть четко рассчитано во времени для того, чтобы постоянно давать определенное количество продукта. Подобная система должна быть точно синхронизирована. Данных о сроках хранения и продолжительности жизни, полученных в культуре тромбоцитов пока нет, и предположительно, время на их использование ограничено 5 сутками. В связи с этим потребуется по- строение определенных схем их использования. Не последними остаются также моменты о законодательном регулировании в использовании клеточных продуктов и их безопасности. Тромбоциты в этом плане выгодно отличаются от других клеток, по той причине, что не имеют ядра и способности к онкогенезу, и могут быть подвергнуты облучению перед использованием. Текущие успехи и огромный интерес показывают нам, что область развивается очень быстрыми темпами и вероятно уже в ближайшем будущем тромбоциты, полученные в культуре, станут альтернативой тромбоцитам, полученным от доноров.

EX VIVO HUMAN PLATELET PRODUCTION

Samara Regional Center of Family Planning and Reproduction