Породные особенности аллельного профиля генов, контролирующих молочную продуктивность крупного рогатого скота

Повышение экономической эффективности животноводства является одной из главных задач современной сельскохозяйственной науки и практики. Селекционный процесс требует интенсивного использования животных с выдающимися показателями, повторяющимися в последующих поколениях. Идентификация таких животных стала возможной благодаря молекулярно-генетическим методам.

Сопоставления молекулярно-генетических маркеров с хозяйственно полезными признаками основаны на современных методах селекции. Это по своей сути ин- тегрированный подход, тесно связывающий генотип с фенотипом, что позволяет выявить для целенаправленного использования в практической селекции ценный генетический материал. В настоящее время для решения целого ряда вопросов практически все чаще и чаще используются молекулярно-генетические маркеры. Генетические маркеры необходимы при определении видовой принадлежности, выяснении степени родства в популяциях животных, различных групп, их генетического полиморфизма, для обнаружения того или иного полезного признака в практических целях, что делает его не толь- ко объективным, но и менее затратным, ускоряя тем самым селекционный процесс. Совершенно не случайно в настоящее время вопрос внедрения прогрессивных ДНК-технологий находится в центре внимания специалистов, работающих в условиях рыночного скотоводства, так как привлечение информации о генетических маркерах меняет рыночную ценность животных [1, с. 54; 2, с. 44].

Для использования данных генетического тестирования в практической селекции необходимы сведения о наличии полиморфных вариантов потенциальных генов-маркеров, встречающихся с частотой, удобной для идентификации в популяции представителей с необходимыми генотипами. Выявление перспективных для использования в практике разведения генетических маркеров позволит продолжить исследования по выявлению взаимосвязи уровня желаемых хозяйственно полезных признаков с определенным генотипом. Выявление животных с желаемым генотипом является одним из важных мероприятий в формировании стад, популяций, консолидированных по предполагаемому уровню продуктивности и племенной ценности [3, с. 7].

В перспективе исследование полиморфизма потенциальных генов хозяйственно полезных признаков крупного рогатого скота может стать отправной точкой в интенсификации отрасли, а также поможет решить множество задач по сохранению и рациональному использованию отечественных пород молочного скота.

В качестве перспективных генетических маркеров, ассоциированных с молочной продуктивностью крупного рогатого скота, выделяют пролактин (PRL), соматотропин (GH), гипофизарный фактор транскрипции (PIT-1). Пролактин (PRL) относится к семейству белковых гормонов, расположен на 23 хромосоме, состоит из пяти экзонов, четырех интронов. Он, являясь одним из универсальных гормонов гипо- физа, участвует в инициации и поддержании лактации у крупного рогатого скота [2, с. 45; 4, с. 119; 5, с. 501]. Полиморфизм пролактина представлен тремя генотипами: АА, ВВ – гомозиготные; АВ – гетерозиготные варианты.

Ген соматотропин (GH) – обладает инсулиноподобным, лактогенным, жиромоби-лизирующим и нейтронным действием. Он синтезируется в передней доле гипофиза, основной его биологический эффект заключается в регуляции постнатального развития, с одной стороны, стимуляции метаболизма, лактации, состава молока – с другой [6, с. 37]. В структуре и регуляторной частях аллельные варианты гена GH важны с точки зрения их прямого и опосредованного влияния на качество молока и молочную продуктивность [7, с. 12]. Полиморфизм гена GH представлен тремя генотипами (LL, LV, VV) и двумя (L, V) аллелями. Рядом исследователей установлено, что ген GH, контролирующий синтез соматотропина, также регулирует рост и развитие животного, играет ключевую роль в углеводном и жировом обмене. В позиции нуклеотидной последовательности 2141 происходит замена цитозина на гуанин, в полипептидной цепи положении 127 влечет замену синтеза аминокислоты лейцин (Leu) на валин (Val) [8, с. 87; 9, с. 39].

Особое место в детерминации молочной продуктивности занимает гипофизарный фактор транскрипции (PIT-1). В регуляции этого процесса он рассматривается как третья, самая высокая ступень. Доказано, что на ранних этапах эмбриогенеза этот ген направляет дифференциацию клеток гипофиза, также определяет развитие зон, ответственных за синтез соматотропина, пролактина, и участвует в регуляции экспрессии их генов. Полиморфизм гена PIT-1 представлен тремя (АА, ВВ, АВ) генотипами и двумя (А, В) аллелями [2, с. 45; 10, с. 235].

Вышеизложенное предопределило цель, своевременность настоящих исследований и их актуальность: изучить породные особенности аллельного полиморфизма генов, контролирующих продуктивность, выявить селекционно значимые генотипы в стадах молочного скота основных пород, разводимых в племенных хозяйствах Ставропольского края.

Материалы и методы исследований

Работа выполнялась в племенных хозяйствах Ставропольского края, занимающихся разведением молочного скота айрширской, ярославской, красной степной пород, кровь которых служила биологическим материалом для выделения ДНК с использованием набора реагентов «DIAtomtmDNAPrep» (IsoGeneLab, Москва). Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) применялись наборы «GenePakPCRCore» (IsoGeneLab, Москва). Методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) проводилось генотипирование исследуемого поголовья молочного скота по генам PRL, GH, PIT-1 (табл. 1) .

На программируемом термоциклере «Терцик» фирмы «ДНК-технология» (Россия) четырехканальном в объеме 20–25 мкл с использованием праймеров осуществлялась полимеразно-цепная реакция.

Электрофоретическим методом в 1,5– 2,0% агарозном геле при УФ-свете после окрашивания бромистым этидием определялось число и длина фрагментов рестрик- ции. С помощью компьютерной системы гель-документирования анализировалась. Стандартный набор М 50 «Gene Pak DNA Markers» (IsoGeneLab) использовали в качестве маркера молекулярных масс.

Генетико-статистический анализ осуществлялся с использованием формул.

Частота встречаемости генотипов устанавливали по формуле:

p = n / N, где:

р – частота определяемого генотипа;

n – количество особей, имеющих определенный генотип;

N – общее число особей.

При подсчете частоты встречаемости аллелей использовалась формула:

Р(А) =

2N₂ + N₂ 2n

где:

P – частота встречаемости аллели;

N₁ – число гомозигот по исследуемому аллелю;

N₂ – число гетерозигот по исследуемому аллелю; n – объем выборки.

Математический расчет теоретически ожидаемого числа животных и критерия соответствия Пирсона по каждому исследуемому гену проводился с использованием формул:

Таблица 1. Характеристика аллельных вариантов

Нуклеотидные последовательности	To С, отжига праймеров	Генотипы	Амплификат (п.н.)	Рестриктаза / замена нуклеотида
PRL
F:5’-cgagtccttatgagcttgattctt-3’ R:5’-gccttccagaagtcgtttgttttc -3’	63	АА/АВ/ВВ	156	RsaI / А→G
GH
F:5’-gctgctcctgagccttcg -3’ R:5’-gcggcggcacttcatgaccct-3’	65	VV/VL/LL	223	AluI / C→A
PIT-1
F:5’- caatgagaaagttggtgc -3’ R:5’-tctgcattcgagatgctc -3’	55	AA/AB/BB	660	HinfI / А→G

Nii = Pi²N – для гомозигот;

Nij = PiPj2N – для гетерозигот, где:

Nii, Nij – теоретически ожидаемое число животных;

Pi, Pj – частота i и j аллелей;

N – общее количество животных.

х2 = L (Ф - Т)2 / Т, где:

Ф – фактически наблюдаемое количество животных каждого генотипа;

Т – теоретически ожидаемое число животных каждого генотипа.

Уровень гомозиготности (Са) рассчитывался:

Са = Р(А)2 + Р(В)2 • 100%.

Число эффективно действующих аллелей (уровень полиморфности локуса, Na):

Na = 1 / Са, где:

Na – уровень полиморфности локуса;

Са – уровень гомозиготности локуса.

Степень генетической изменчивости популяции ( V ) выражается через коэффициент (по А. Робертсону):

V = 1 - Са /1 -1 / N • 100, где:

N – количество животных;

Са – коэффициент гомозиготности;

ТГ – тест гетерозиготности – отношение фактической гетерозиготности к теоретической.

Результаты исследований и их обсуждение

Анализом результатов генотипирования установлено, что полиморфизм изучаемых генов представлен, как правило, двумя аллелями с разной частотой встречаемости.

Характерной особенностью полиморфизма пролактина (PRL), представленного аллелями (А и В), стали достаточно высокая частота встречаемости аллеля В (0,65) в стаде коров айрширской породы и в два раза реже (0,35) – встречаемость аллеля А. Присутствие гомо-, гетерозиготных генотипов (АА, ВВ, АВ) в этом стаде коров составило: 20,0; 51,0; 29,0% соответственно. Достаточно низкая (0,28) частота встречаемости аллеля А этого же гена, но высокая (0,72) аллеля В обеспечила сравнительно высокую (62,0%) частоту встречаемости гомозиготного (ВВ) генотипа, низкую (18,0%) генотипа (АА) в стаде коров ярославской породы. В два раза реже встречалась аллель А гена пролактина в стаде коров красной степной породы: 0,33, против 0,67, что обусловило наличие 54,0 гомозиготных ВВ и 19,0% – АА генотипов.

Для полиморфизма гена соматотропина (GH), представленного двумя аллелями V и L, характерно сравнительно равномерное межпородное распределение, составившее для аллеля V – 0,45, для аллеля L – 0,56 среди коров айрширской, 0,32 и 0,36; 0,68 и 0,64 – среди коров ярославской и красной степной пород (табл. 2) .

Выявлены существенные различия в частоте встречаемости гомозиготных VV и LL, гетерозиготных VL генотипов: частота встречаемости гомозиготного VV генотипа в стаде айрширской породы составила 37,0%, против 18,0 и 13,0% -ярославской и красной степной. Частота встречаемости гомозиготного LL генотипа в исследуемых стадах варьировала от 41,0 до 55,0%.

Присутствие аллелей А и В гена PIT-1 с частотой встречаемости 0,38 и 0,62 в стаде коров айрширской породы нашло отражение в наличии гомо- и гетерозиготных генотипов: АА – 25,0; ВВ – 48,0 и 27,0% соответственно. Специфичность концентрации аллелей А и В этого гена, составившая 0,32 и 0,68 среди животных ярославской породы, нашла отражение в присутствии

Таблица 2. Аллельный профиль генов крупного рогатого скота молочного направления продуктивности

Показатель PRL GH PIT-1 генотип генотип генотип АА (A) АВ ВВ (B) VV (V) LV LL (L) АА (А) АВ ВВ (B) Айрширская (n=73) Частота аллеля 0,35 0,65 0,45 0,56 0,38 0,62 Частота генотипов 0,20 0,29 0,51 0,37 0,16 0,47 0,25 0,27 0,48 Частота генотипов, % 20,0 29,0 51,0 37,0 16,0 47,0 25,0 27,0 48,0 Ярославская (n=158) Частота аллеля 0,28 0,72 0,32 0,68 0,32 0,68 Частота генотипов 0,18 0,20 0,62 0,18 0,27 0,55 0,21 0,23 0,56 Частота генотипов, % 18,0 20,0 62,0 18,0 27,0 55,0 21,0 23,0 56,0 Красная степная (n=108) Частота аллеля 0,33 0,67 0,36 0,64 0,37 0,63 Частота генотипов 0,19 0,27 0,54 0,13 0,45 0,41 0,22 0,32 0,48 Частота генотипов, % 19,0 27,0 54,0 13,0 45,0 41,0 22,0 32,0 48,0 Источник: результаты исследований авторов. гомозиготных (АА, ВВ) и гетерозиготных (АВ) генотипов, соответственно: 21,0; 56,0; 23,0%. Вариабельность частоты встречаемости аллеля А (0,37), аллеля В (0,63) обеспечила присутствие в стадах красностепной породы гомозиготных (АА, ВВ), гетерозиготного (АВ) генотипов, соответственно: 22,0; 48,0; 32,0%.

Использование генетико-статистических методов анализа путем определения цифровых значений таких генетических констант, как степень гомозиготности (Са), уровень полиморфности (Na), степень генетической изменчивости (V), дало оценку генетической структуры изучаемых пород.

Степень гомозиготности (Са), свидетельствующая о консолидации генов, контролирующих молочную продуктивность, была сравнительно одинаковой у всех изучаемых пород (айрширской, ярославской, красной степной), составила, соответственно, 54,5; 59,8; 55,8% – для гена PRL; 51,6; 56,5; 53,9% – для гена GH; 52,9; 56,5; 53,4% – для PIT-1. Число эффективно действующих аллелей генов пролактина (PRL), соматотропина (GH), гипофизар- ного фактора транскрипции (PIT-1) было наиболее высоким у коров айрширской породы, составило, соответственно, 1,83; 1,93; 1,89, наименьшее: 1,67; 1,77; 1,77 – у ярославской породы. Сравнительный анализ уровня наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности в исследуемых популяциях молочного скота свидетельствует о неоднозначности характера его распределения в изучаемых генах. Вариабельность наблюдаемой гетерозиготности гена пролактина (PRL) была незначительной у коров айрширской и красной степной пород, составило 0,404 и 0,367, несколько ниже – 0,254 - у ярославской породы (табл. 3).

Значительная вариабельность этого показателя была характерна для гена соматотропина (GH): от минимальных значений (0,196) у айрширов до максимальных (0,830) у животных красной степной породы. Сравнительно одинаковый уровень наблюдаемого гетерозиготного гена (PIT-1) – 0,377; 0,306; 0,421 – обнаружен у всех исследуемых пород молочного скота. Вариабельность ожидаемой гетерозиготности зависела как от породной

Таблица 3. Породные особенности генетической структуры молочного скота

Показатель Порода айрширская ярославская красная степная Ген пролактин (PRL) Количество гомозигот (n) 52 126 79 Количество гетерозигот (n) 21 32 29 Наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) 0,404 0,254 0,367 Ожидаемая гетерозиготность (Hex) 0,836 0,675 0,792 Степень гомозиготности (Са), % 54,5 59,8 55,8 Уровень полиморфности (Na) 1,83 1,67 1,79 Степень генетической изменчивости (V), % 45,4 40,1 44,1 Тест гетерозиготности (ТГ) -0,43 Ф < Т -0,42 Ф < Т -0,42 Ф < Т Ген соматотропин (GH) Количество гомозигот (n) 61 115 59 Количество гетерозигот (n) 12 43 49 Наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) 0,196 0,374 0,830 Ожидаемая гетерозиготность (Hex) 0,976 0,770 0,857 Степень гомозиготности (Са), % 51,6 56,5 53,9 Уровень полиморфности (Na) 1,93 1,77 1,85 Степень генетической изменчивости (V), % 48,3 43,4 46,0 Тест гетерозиготности (ТГ) -0,78 Ф < Т -0,39 Ф < Т -0,03 Ф < Т Ген гипофизарный фактор транскрипции (PIT-1) Количество гомозигот (n) 53 121 76 Количество гетерозигот (n) 20 37 32 Наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) 0,377 0,306 0,421 Ожидаемая гетерозиготность (Hex) 0,891 0,771 0,873 Степень гомозиготности (Са), % 52,9 56,5 53,4 Уровень полиморфности (Na) 1,89 1,77 1,87 Степень генетической изменчивости (V), % 47,0 43,4 46,5 Тест гетерозиготности (ТГ) -0,51 Ф < Т -0,46 Ф < Т -0,45 Ф < Т Источник: результаты исследований авторов. принадлежности животных, так и от гена. Наиболее высоким изучаемый показатель для гена PRL, GH, PIT-1 оказался у коров айрширской породы, составил, соответственно, 0,836; 0,976; 0,891, несколько ниже: 0,792; 0,830; 0,873 – у коров красной степной породы, еще ниже: 0,675; 0,720; 0,771 – у животных ярославской породы.

Что касается теста гетерозиготности, отражающего отклонение частот встречаемости гетерозиготных генотипов от теоретически ожидаемой доли гетерозигот согласно закону Харди-Вайнберга, то его величина у всех изучаемых пород молочного скота оказалась отрицательной и сравнительно одинаковой: -0,43; -0,42; -0,42 – для PRL; -0,51; -0,46; -0,45 – для PIT-1; неоднозначной: -0,78; -0,39; -0,03 – для GH.

Таким образом, исследованиями генетической сбалансированности стад молочного скота установлено своеобразие генетической структуры, зависящей как от породы, так и от гена.

Генетико-статистическими методами анализа установлено, что доля животных, имеющих желательный комплексный ге-

Таблица 4. Частота встречаемости желательных генотипов среди молочного скота Ставропольского края

Желательные генотипы	Число генов/аллелей	Частота встречаемости, %
PRLBBGHVVPIT-1AA	3/6	3,1
PRLBBPIT-1AA	2/4	17,4
GHVV	1/2	68,7
Источник: результаты исследований авторов.

Таблица 5. Распределение селекционно значимых генотипов, %

Порода	Селекционно-значимые генотипы
	PRLBBGHVVPIT-1AA	PRLBBPIT-1AA	GHVV
Айрширская	1,5	4,9	18,1
Ярославская	0,9	7,5	24,4
Красная степная	1,2	5,8	20,3

Источник: результаты исследований авторов.

нотип, включающий 6 маркерных аллелей трех генов (PRL^BB GH^VV PIT-1^AA), составила 3,1, комбинация из 4 маркерных аллелей и двух генов (PRL^BBPIT-1^AA) – 17,4, носители 2 маркерных аллелей одного гена – 68,7% (табл. 4–5) .

Сравнительным анализом распределения в стадах молочного скота особо ценных генотипов выявлено, что доля животных, имевших желательный комплексный генотип, включающий 6 маркерных аллелей трех генов, в стаде коров айрширской породы составила 1,5; ярославской – 0,9; красной степной – 1,2%, доля животных с 4 маркерными аллелями двух генов, соответственно: 7,5; 4,9; 5,8%.

Заключение

Методами ДНК-диагностики выявлены межпородные особенности полиморфизма генов, контролирующих продуктивность молочного скота, частота встречаемости которых зависела от породы и варьировала в широких пределах: от полного отсутствия 0 до 60,0%. Установлено, что доля животных – носителей гомозиготного желательного генотипа по трем генам, включающего шесть маркерных аллелей, составила 3,1, по двум генам и четырем маркерным аллелям – 17,4 и 2 аллеля 1 гена – 68,7%. Результаты генотипирования свидетельствуют о том, что удельный вес особо ценных генотипов в племенных стадах молочного скота, разводимого на Ставрополье, сравнительно низок.

Регулярное проведение скрининговых работ по выявлению желательных генотипов создаст условия для накопления селекционно значимых генетических маркеров в племенных стадах молочного скота, разводимого в хозяйствах Ставропольского края.