Повышение устойчивости льна-долгунца к антракнозу (Colletotrichum lini Manns et Bolley) методами in vitro

Введение. Важная роль в повышении эффективности развития отрасли льноводства принадлежит новым сортам льна-долгунца. В производственных условиях реализация биологического потенциала сортов составляет 30–35 %, что обусловлено не только несоблюдением технологии возделывания культуры, но и влиянием неблагоприятных факторов среды. Большинство сортов характеризуется низкой приспособленностью к неблагоприятным абиотическим (засуха, кислотность почвы, низкая температура) и биотическим (болезни – антракноз, бактериоз) факторам среды [1; 2; 3].

Антракноз – болезнь льна, широко распространенная в его посевах. Встречается ежегодно. Во время всходов льна сильное поражение посевов данным патогеном вызывает изреживание стеблестоя, а иногда и полную гибель растений. Однако степень вредоносности антракноза зависит от почвенно-климатических и агротехнических условий выращивания льна-долгунца. В настоящее время проблема устойчивости льна к антракнозу приобретает все большее значение. Идентификация генофонда культуры по данному признаку не позволила выявить устойчивые к патогену формы. Выявлено ограниченное количество среднеустойчивых форм, которые, как правило, являются межеумками [2].

Определение уровня устойчивости растений льна к антракнозу, а также возможности биотехнологического и селекционного изменения этого уровня, несомненно, является актуальной проблемой.

Материал и методы. В качестве объекта исследования был использован лен культурный (Linum usitatissimum L., 2n = 30): 2 сортальна долгунца Ленок, Росинка, восприимчивые к антракнозу; 21 линия (НЛ-40-2, НЛ-40-1, НО-76, НЭ-38, НЭ-36, НЭ-15 и др.), полученные в лаборатории биотехнологии ВНИИЛ при отборе in vitro, относительно устойчивые к антракнозу.

Для создания культурального фильтрата использовали сильновирулентные 680, 677*, средневирулентный 674 и слабовирулентный штамм 674* - быстрорастущие штаммы возбудителя антракноза с обильным спороношением.

Искусственная полевая популяция биообразцов возбудителя антракноза для заражения льна состояла на 50 % из сильновирулентных (725, 726, 729, 730, 735, 739) и по 25 % средне- (724, 737, 728, 724) и слабовирулентных (712, 714) штаммов.

Родительские формы высевали в сосудах Митчерлиха в вегетационном домике согласно методике Доспехова [4]. Размножение гибридного материала и чистых линий льна осуществляли на светоустановке (осенне-зимний период) и в условиях вегетационного домика (весенне-летний период). Скрещивания про водили по схеме: ______________________

$	^Ленок	^Росинка
НЭ-36	+	+
НЭ-17	+	+
НЭ-17-5	+	+
НЭ-17-2	+	+
НО-85	+	+
НЭ-38	+	+
НО-65	+	+

Оценку растений-регенерантов и линий выполняли с использованием «Методических рекомендаций по созданию, поддержанию, хранению и практическому использованию «Коллекции микроорганизмов возбудителей болезней льна» [5].

Селекцию in vitro на устойчивость к антракнозу проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Получение регенерантов льна-долгунца, устойчивых к антракнозу, методами in vitro » [6].

Интенсивность спороношения возбудителя антракноза определяли в капле дистиллированной воды с помощью камеры Горяева с использованием микроскопа МБИ-6. Количество спор в 1 см³ рассчитывали по формуле: N / 20 х 10⁶, где N - количество спор в поле зрения микроскопа в камере Горяева.

Фитотоксические свойства культурального фильтрата (КФ) определяли путём замачивания в нём семян льна в течение 24 ч по методике Курчаковой [7].

Результаты и обсуждение. Для культивирования незрелых зародышей на начальном этапе селекции моделировали селективный фон, приближенный к полевым условиям, и использовали для внесения в питательную среду Sh-2 КФ, состоящий из смеси штаммов (два сильновирулентных и по одному средне- и слабовирулентному штамму), взятых в равных количествах (по 1 мл, по 2, 3, 4, 5, 6…11 мл). После 10–14 суток инкубации незрелых зародышей наблюдалось появление двух типов структур - каллуса и (или) побегов. Стимулирование пролиферации каллуса было отмечено при концентрациях КФ 28, 32 и 36 мл/л, что позволило получить, в зависимости от генотипа, первичный морфогенный каллус (15-58 %). В этих вариантах, кроме морфогенных каллусных очагов, формировались стекловидные, слабохлорофилльные побеги. На средах с более низкой концентрацией КФ (4; 8; 12; 16; 20; 24) наблюдалось стремительное нарастание водянистой клеточной биомассы, при этом морфогенные очаги не формировались либо формировались в единичных количествах. В вариантах, где КФ добавляли в среду в количестве 40 и 44 мл/л, формировался твердый каллус без признаков морфогенеза.

На этапе субкультивирования каллуса использовали три концентрации КФ: 32,

36 и 40 мл/л, которые добавляли в среду Sh-2. В ходе исследований было выявлено, что первичная каллусная ткань, сформированная на селективной среде, обладала пролиферативной способностью и морфогенетической активностью в отличие от первичной каллусной ткани, сформированной на среде, свободной от КФ. Было отмечено некоторое ингибирование роста (0–31 %) и развития каллуса на среде, содержащей 32 и 36 мл/л КФ. В этих вариантах были сформированы морфогенные очаги и у некоторых генотипов получены побеги, однако они были слаборазвитые и уродливые. В варианте использования КФ в концентрации 40 мл/л морфогенные участки не развивались и клетки каллуса через неделю погибали.

Морфогенная каллусная ткань, перенесённая в следующих пассажах на среду Sh-2, не содержащую КФ, продолжала развиваться и формировать морфогенные очаги, в которых формировались побеги льна. В результате такой селекции из восприимчивых к антракнозу генотипов получены растения-регенеранты, устойчивые к культуральному фильтрату in vitro .

Растения оценивали по устойчивости к антракнозу в условиях in vitro и на искусственном инфекционно-провокационном фоне. Для проведения оценки in vitro в питательную среду Sh-2 добавляли КФ в концентрации 36 мл/л. Установлено, что процентное количество сформированного морфогенного каллуса в первом и втором пассажах было близким по значению к полевой устойчивости растений к антракнозу. Так, на селективном фоне in vitro у линии НЭ-17 × Ленок сформирован в первом пассаже 31 % морфогенных каллусов, во втором – 40 %. Полевая устойчивость на искусственном инфекционнопровокационном фоне была отмечена на уровне 32,5 % (генотип неустойчив к антракнозу). У линии НЭ-38 × Ленок в первом пассаже сформировано 54 % морфогенных каллусов, во втором – 62 %. Полевая устойчивость 62,5 % (генотип устойчив к антракнозу) (табл. 1).

При оценке гибридов F 1–3 и их родительских форм на искусственном инфекционнопровокационном фоне в полевых условиях,

Таблица 1

Формирование морфогенного каллуса в культуре незрелых зародышей после 1–3 пассажей в зависимости от генотипа льна с добавлением в питательную среду культурального фильтрата (КФ) возбудителя антракноза в концентрации 36 мл/л

Генотип Полевая устойчивость к антракнозу, % Количество морфогенного каллуса после пассажа, % ± Sp 1 2 3 Росинка 29 45 ± 3,3 40 ± 3,2 20 ± 4,4 Ленок 38 54 ± 5,2 40 ± 3,2 18 ± 5,1 НЭ-17 × Ленок 32,5 31 ± 4,4 40 ± 3,3 25 ± 4,6 НЭ-38 × Росинка 62,5 70 ± 3,6 60 ± 4,3 54 ± 3,6 НЭ-38 × Ленок 62,5 54 ± 2,8 62 ± 3,5 55 ± 2,2 НЭ-38 66,7 60 ± 3,5 62 ± 2,6 55 ± 2,8 НЭ-17-2 58,3 60 ± 4,4 60 ± 3,7 53 ± 3,4 выявлено, что степень устойчивости гибридов НЭ-38 × Ленок и НЭ-38 × Росинка составила 62,5 % и находилась практически на одном уровне с таковой у исходной формы НЭ-38 (66,7 %), при устойчивости восприимчивых родительских форм 38 (сорт Ленок) и 29 % (сорт Росинка) (табл. 2).

Таблица 2

Устойчивость к антракнозу гибридов льна первого–третьего поколений на инфекционно-провокационном фоне возбудителя антракноза

Гибрид F 1 –F 3	Устойчивость, % ± Sp	Родительская форма	Устойчивость, % ± Sp
НЭ-36 × Ленок	25 ± 2,5	НЭ-36	75 ± 1,7
НЭ-17 × Ленок	0 ± 1,4	НЭ-17	57 ± 2,2
НЭ-17-5 × Ленок	25 ± 3,3	НЭ-17-5	75 ± 2,1
НЭ-17-2 × Ленок	41,7 ± 3,7	НЭ-17-2	57 ± 3,2
НО-85 × Ленок	25 ± 1,9	НО-85	43,7 ± 4,4
НЭ-38 × Ленок	62,5 ± 4,4	НЭ-38	66,7 ± 2,1
НО-65 ×Ленок	25 ± 2,6	НО-65	45 ± 2,8
НЭ-36 × Росинка	25 ± 2,8	НЭ-36	75 ± 1,4
НЭ-38 × Росинка	62,5 ± 3,1	НЭ-38	66,7 ± 1,3
НЭ-17 × Росинка	0 ± 1,1	НЭ-17	57 ± 2,2
НЭ-38-8 × Росинка	0 ± 1,8	НЭ-38-8	62,5 ± 4,1
НО-65 × Росинка	25 ± 2,2	НО-65	45 ± 3,4
НО-85 × Росинка	0 ± 0,5	НО-85	43,7 ± 1,5
НЭ-17-5 × Росинка	0 ± 1,1	НЭ-17-5	75 ± 2,4
	29 ± 2,4	Росинка
	38 ± 2,6	Ленок

При анализе других гибридных комбинаций от скрещивания контрастных по устойчивости форм наблюдалась преимущественно высокая степень поражения гибридов (устойчивость 0–25 %). Следовательно, при скрещивании устойчивых линий льна-долгунца, полученных при селекции in vitro, с восприимчивыми сортами устойчивость в последующих поколениях в основном не наследуется. Исключение составили комбинации НЭ-38 × Ленок и НЭ-38 × Росинка с участием устойчивой формы НЭ-38.

Выводы. В результате проведённых исследований установлено, что для повышения устойчивости генотипов льна-долгунца к антракнозу возможно применять биотехнологические приёмы – селекцию in vitro с использованием культуры незрелых зародышей и селективной среды Sh-2. КФ, добавляемый в питательную среду при дифференцировке генотипов льна по устойчивости к антракнозу, может состоять из смеси КФ сильновирулентных (680, 677*), средневирулентного (674) и слабовирулентного (674*) штаммов, взятых в равных концентрациях – по 9 мл/л каждого штамма. В этом случае количество сформированного морфогенного каллуса и полевая устойчивость генотипа к антракнозу близки по значению, и можно делать заключение о характере устойчивости. При скрещивании устойчивых линий льна-долгунца, полученных при селекции in vitro , с восприимчивыми сортами, устойчивость в последующих поколениях в основном не наследуется. Исключение составили комбинации НЭ-38 × Ленок и НЭ-38 × Росинка с участием устойчивой формы НЭ-38.