Применение альфа - фетопротеина в иммунофармакологии - история вопроса

Альфа-фетопротеин (АФП) – одноцепочечный гликопротеин (Mr 68–75 кДа, 3–5% углеводов), который синтезируется в период раннего развития эмбриона в желточном мешке, а затем в печени и желудочно-кишечном тракте плода. Во время беременности концентрация АФП в крови растет, достигая значений 150‒250 МЕ/мл, тогда как после родов его уровень резко снижается [Terentiev, Moldogazieva, 2013]. Известно, что АФП способен проникать через фетоплацентарный барьер в мате- ринский кровоток, а изменение его уровня используется в диагностическом тесте для обнаружения некоторых аномалий развития плода. Помимо этого, АФП является опухолевым маркёром, ассоциированным с первичным раком печени и гепатокарциномой [Terentiev, Moldogazieva, 2013].

Основной функцией АФП является перенос низкомолекулярных веществ от матери к плоду. АФП способен связывать различные гидрофобные лиганды и ионы металлов, выполняя функцию основного транспортного белка во время эмбрионального развития [Deutsch, 1991]. В частности,

АФП способен связывать и переносить такие лиганды, как билирубин, жирные кислоты, стероиды, ретиноиды, флавоноиды, фитоэстрогены, красители, тяжелые металлы и диоксин, а также различные лекарственные препараты [цит. по Шмагель, 2003]. Таким образом, АФП может быть использован в фармакологии в качестве адресной доставки необходимых веществ [Pak, 2018].

Иммуномодулирующие эффекты молекулы АФП

Известно, что АФП способен проникать через фетоплацентарный барьер в материнский кровоток, взаимодействуя при этом с клетками иммунной системы. Несмотря на то, что АФП обладает иммуносупрессивными эффектами, его роль в формировании иммунной толерантности в период беременности на уровне современных субпопуляций остается еще мало исследованной [Schumacher, Costa, Zenclussen, 2014]. Так, показано, что АФП, полученный из пуповинной крови человека, не оказывает эффектов на функциональную активность NK-клеток напрямую, однако, подавляет их цитолитическую активность опосредованно через дендритные клетки [Yamamoto et al., 2011]. В 2016 г. было обнаружено, что рекомбинантный АФП в эмбриональных концентрациях способен индуцировать апоптоз регуляторных B-лимфоцитов, что может указывать на фетопротек-торный механизм его действия. При этом АФП не оказывал влияния на активность данных клеток в концентрациях, соответствующих их уровню в материнской сыворотке [Fettke et al., 2016]. Ранее нашими исследованиями установлено, что АФП, полученный из периферической крови беременных женщин, способен регулировать дифференцировку регуляторных T-лимфоцитов, которые, в свою очередь, ограничивают иммунный ответ на фетопла-центарные антигены [Черешнев и др., 2017]. В 2019 г. стало известно, что альфа-фетопротеин способен к регуляции функциональной активности как наивных T-клеток, так и Т-клеток памяти. Исследование показало, что АФП препятствует конверсии наивных Т-хелперов в эффекторные субпопуляции Т-клеток памяти и снижает суммарную продукцию ИЛ-4 и ИФН-γ исследуемыми популяциями [Заморина и др., 2019а]. Наряду с этим, не было выявлено его эффектов в отношении дифференцировки провоспалительной субпопуляции Th17, однако оказалось, что АФП способен модулировать цитокиновый профиль этих клеток. Так, АФП в концентрациях 50 и 100 МЕ/мл повышал продукцию IL-2 активированными T-хелперами 17 типа, одновременно подавляя синтез IFN-γ [Замо-рина и др., 2019б].

На основании достаточно большого объема данных об иммуносупрессивном действии АФП, в разное время создавались и создаются фармакологические препараты, содержащие рекомбинантный или эмбриональный АФП: альфетин, профеталь, ММ-093, ACT 101. Данные препараты предназначены, прежде всего, для терапии аутоиммунных, а также онкологических заболеваний, при условии конъюгирования их с токсинами. Несмотря на то, что при ряде заболеваний уже продемонстрирована эффективность применения АФП, не существует чёткой концепции, которая смогла бы объяснить механизм его иммуномодулирующего действия.

История применения эмбриональных тканей в качестве лекарственного средства

Первый опыт применения эмбриональных субстанций в качестве лечения различных заболеваний был получен в начале прошлого столетия. Именно тогда наблюдались определенные положительные эффекты от использования мазей, гомогенатов и экстрактов эмбриональных тканей, которые были использованы в качестве лечения экспериментальных инфицированных ран у крыс, а также трофических язв у человека. Теоретическая гипотеза Дж. Фичера, предполагающая, что основной причиной злокачественного роста является нарушение некого «онкогенного равновесия» в организме, привела к тому, что уже в 1930-х гг. гомогенаты и экстракты из эмбриональных тканей использовались как средства борьбы с опухолевыми заболеваниями. В результате такой терапии у онкологических больных был остановлен рост опухоли, а у некоторых пациентов наблюдалось полное рассасывание новообразований [цит. по: Черешнев и др., 2004]. Помимо этого, в 30-х гг. ХХ в. впервые в качестве вакцин были использованы экстракты эмбриональных тканей. Было показано, что введение крысам аллогенной эмбриональной ткани за 2‒3 недели до пересадки саркомы Иенсена приводит к отторжению опухолевых клеток [Ольшанецкая, 1939]. В данной работе при лечении опухолей у крыс были получены следующие результаты: уменьшение опухоли, либо торможение ее роста во время инъекций и возобновление роста после прекращения лечения; увеличение продолжительности жизни крыс с опухолью, несмотря на ее размеры. У крыс, которых лечили эмбриональными экстрактами, наблюдалось отсутствие метастазов, а также снижение прививаемости опухоли у тех животных, которым ранее был введен эмбриональный экстракт. Именно тогда стало очевидно, что плацента и клетки тканей эмбриона способны выделять факторы, тормозящие опухолевый рост.

Особое внимание уделялось исследованиям роста опухоли во время беременности на модели жи- вотных. Например, было обнаружено, что у беременных крыс рост карциномы задерживался на 33, а рост саркомы на 75%. Однако, после родов рост опухолей у этих животных ускорялся [Мищенко, Фоменко, Бурнас, 1930].

Позднее, в 1944 г., при лечении плохо заживающих ран у человека впервые применили 10%-ную мазь из эмбрионов животных, в результате чего был получен выраженный противовоспалительный эффект [цит. по: Черешнев и др., 2004].

В начале 80-х гг. накопленный объем данных о положительных эффектах использования эмбрионального экстракта в борьбе с рядом опухолевых заболеваний дал возможность многим странам применить препараты из эмбриональных тканей как в противоопухолевой терапии, так и при лечении не онкологических заболеваний, таких как болезни крови, иммунные расстройства, ожоги и хирургические раны. В частности, такие исследования проводили Франция, США, Германия [Патент …, 1979; Solisch, Bergman, Granzaw, 1983; Mc Michael, 1990].

В литературе имеются данные успешного применения методов аллотрансплантации и ксенотрансплантации тканей при лечении таких заболеваний, как сахарный диабет [Саркисов, Пальцин, Втюрин, 1975; Малайцев и др., 1994], болезнь Дауна у детей [Панченко и др., 1994], а также в гематологии [Сухих и др., 1994].

Очевидно, что основными компонентами эмбриональных экстрактов являются онкофетальные белки. Помимо них в препаратах из эмбриональных и плацентарных тканей содержатся комплексы биологически активных веществ, таких как интерлейкины (IL), интерфероны (IFN), макрофаг-стимулирующие факторы (M-CSF) и др. [Череш-нев и др., 2004]. Именно поэтому для выяснения механизма действия эмбриональных экстрактов важны высокая очистка и выделение конкретного белка, что стало возможным с развитием современных технологий.

Препараты на основе очищенного

АФП

ММ-093

Так, компания Merrimack Pharmaceuticals получила синтетическую форму АФП (MM-093) и предприняла попытки использования этого белка как иммуносупрессорного агента [Dudich, 2007]. MM-093 – это негликозилированная рекомбинантная версия человеческого АФП, которая была получена из молока трансгенных коз с использованием технологии рекомбинантных ДНК [Parker et al., 2004]. В исследованиях данной компании была проведена оценка терапевтического потенциала препарата в отношении ревматоидного артрита.

Авторы продемонстрировали определенные положительные эффекты использования MM-093. Несмотря на то, что исследование было проведено среди небольшой выборки людей (n = 12), полученные результаты позволили предположить, что препарат MM-093 обладает фармакологическим потенциалом [Pollard et al., 2007].

Однако, несмотря на то, что MM-093 успешно прошёл первый и второй этапы клинических испытаний, пока нет данных, подтверждающих введение препарата в третью фазу испытаний, для которой характерна большая выборка испытуемых людей [URL: DB0 5512].

ACT-101

Компания Alpha Cancer Technologies разработала рекомбинантный белок АФП под названием ACT-101 для лечения заболеваний, связанных с дисбалансом иммунной системы. В проведенном исследовании приняло участие 79 пациентов, страдающих от воспалительного заболевания кишечника. АФП вводили подкожно в течение 30 дней. На основании результатов исследования стало очевидно, что АФП значительно уменьшил симптомы заболевания. Помимо этого, ACT-101 прошел первую и вторую фазы клинических испытаний, проводимых среди 300 пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями. Результаты исследования продемонстрировали способность ACT-101 снижать аутоиммунное воспаление, при этом побочных эффектов обнаружено не было [URL: ]. Однако, начиная с 2018 г., не было никакого подтверждения продолжения испытаний препарата ACT-101.

Альфетин/профеталь, альфа-фетопротеин

В 1999 г. в России был зарегистрирован препарат, разработанный на основе альфа-фетопротеина («Альфетин» 75 мкг/амп) и полученный из абортивной крови, прошедшей строгий контроль на отсутствие контаминации вирусами СПИД, гепатитов В и С, возбудителями других инфекций. Исследование данного препарата было проведено с соблюдением всех необходимых требований, предъявляемых к клиническим испытаниям [Че-решнев и др., 2004].

Производители рекомендовали препарат для применения в комплексной терапии аутоиммунных заболеваний и других иммунопатологических состояний, обусловленных нарушением синтеза цитокинов, регулирующих T-клеточный иммунитет (неспецифический язвенный колит, болезнь Хашимото) [URL: ].

Однако в 2001 г. на основании постановления ВОЗ был разработан усовершенствованный препарат «Профеталь». Этот препарат использовался в составе комплексной терапии неспецифического язвенного колита; аутоиммунного тиреоидита (болезнь Хашимото); хронических окклюзионных заболеваний сосудов (тромбангииты, облитерирующие эндартерииты, атеросклероз, инфекционноаллергические артерииты).

После выхода на фармакологический рынок лекарственного препарата «Профеталь» началось активное исследование воздействия АФП на компоненты иммунной системы, а также на опухолевые клетки. Было показано, что «Профеталь» способен стимулировать пролиферацию и индукцию дифференцировки эмбриональных фибробластов [Dudich et al., 2000], а его определенные концентрации индуцируют созревание дендритных клеток и повышают цитотоксическую и пролиферативную способность мононуклеарных лейкоцитов [Черешнев и др., 2005]. Кроме того, в условиях системы in vitro было обнаружено, что препарат обладает прямым антипролиферативным действием на опухолевые клетки [Родионов и др., 2006а].

Помимо этого, в 2006 г. было показано, что препарат эффективен при комплексном лечении злокачественных опухолей через реализацию иммунных механизмов и усиление цитотоксического действия химиотерапии в отношении опухолевых клеток. В этом же исследовании авторы пришли к выводу, что препарат позволяет избежать ряда осложнений и побочных эффектов, вызванных применением химиотерапевтических лекарственных средств. Авторы предположили, что механизм действия препарата «Профеталь» основан на комплексной регуляции клеточного деления. АФП инициирует саморазрушение опухоли, блокирует феномен «экранирования опухоли», связывает химиопрепараты и транспортирует их непосредственно в опухолевую ткань, активирует клеточное звено противоопухолевого иммунитета и, кроме того, проявляет гепатопротекторные, мембраностабилизирующие, противовоспалительные и десенсибилизирующие свойства [Родионов, 2006б].

Исследование препарата «Профеталь» проводилось в соответствии со всеми необходимыми требованиями, предъявляемыми к клиническим испытаниям, тем не менее, в 2008 г. производство препарата «Профеталь» было приостановлено.

В настоящее время лекарственная форма АФП производится несколькими фармацевтическими компаниями [URL: ].

Пептидные фрагменты С14-20 АФП

Исследования, проведенные на экспериментальных моделях in vitro и in vivo, показали, что АФП обладает разной биологической активностью, поэтому было сделано предположение, что белок содержит множество функционально важных участков [Mizejewski, 2001]. В составе многих бел- ков с регуляторными функциями были обнаружены линейные последовательности (порядка 3‒10 а.о.), которые способны принимать участие в передаче сигнала, опосредовать белок-белковые взаимодействия. В 1997 г. А.А. Терентьев обнаружил сходство между гептапептидным сегментом LDSYQCT, расположенным в N-концевой части молекулы АФП человека (а.о. 14‒20), обозначенным как АФП 14-20, и частью рецепторсвязыва-ющего участка эпидермального фактора роста с последовательностью LDKYACN у человека. На основании этого было сделано предположение, что данный сегмент представляет собой один из биологически активных участков АФП человека. Тем не менее, механизмы его функционирования до сих пор остаются малоизученными.

АФП, конъюгированный с токсинами

Поскольку АФП представляет собой транспортный белок, обладающий выраженными конъюгатными свойствами, он всегда был привлекателен для исследования. На основании того, что АФП является эмбриональным лигандом к рецепторам опухолевых клеток, был успешно проведен ряд исследований целенаправленной доставки цитостатиков, цитотоксинов и гормонов к опухолевым клеткам-мишеням [Черешнев и др., 2004]. Так, большая группа ученых из Японии и Израиля продемонстрировала положительные результаты в лечении злокачественных гепатоцеллюлярных новообразований благодаря применению очищенного АФП, антителами к АФП, а также конъюгатами антител к АФП в комплексе терапии противоопухолевыми соединениями, такими как адриамицин и митомицин [Hirano et al., 2001].

В настоящее время фирма Alpha Cancer Technologies Inc. (ACT, Канада) занимается разработкой препаратов рекомбинантного АФП, конъюгированного с токсинами: ACT-901 (AFP + paclitaxel), ACT-902 (AFP + thapsigargin), ACT-903 (AFP + linker + maytansine). Одной из стратегий фирмы является выход препарата альфа-фетопротеина в качестве транспорта противоопухолевых препаратов на фармакологический рынок.

В 2017 г. исследователи смогли показать, что АФП, конъюгированный с даунорубицином, способен вызывать элиминацию супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) [Belyaev et al., 2018]. Авторы считают, что недостаточность противоопухолевого иммунитета при раке опосредуется MDSC, поэтому эффективное подавление этих клеток может быть одним из потенциальных методов лечения рака. Для этого ученые предложили использовать АФП, конъюгированный с цитотоксическим агентом, в качестве векторной молекулы, специфически распознающей MDSC. Та- кой молекулой в данном исследовании послужил даунорубицин.

Тем не менее, в настоящий момент важно определить, насколько оправдана терапия с применением АФП в лечении ряда заболеваний. Существует определенная вероятность, что белок может провоцировать рост опухолевых клеток [Mizejewski, 2011]. Автор данной статьи связывает это с тем, что молекула АФП при разных условиях окружающей среды (pH, температура, осмоляльность, избыточные концентрации лиганда, окисление и тепловой/глюкозный шок) способна изменять свою конформацию [Mizejewski, 2001]; известно, что биологическая активность АФП зависит от ее конформационного состояния. Так, автор выделяет HAFP (human alpha-fetoprotein) и FL-AFP (full- length alpha-fetoprotein). HAFP имеет компактно сложенную форму и жесткую структуру. При этом HAFP несет молекулярную поверхность, подверженную гидрофильному воздействию при pH = 7 и обладает обширными участками гидрофобного связывания, расположенного в скрытых молекулярных карманах. Известно, что молекула FL-AFP претерпевает небольшую денатурацию и разворачивается в состоянии расплавленной глобулы, которая имеет разрыхление третичной упаковки, в то время как вторичная структура молекулы остается нетронутой [Hajeri‐Germond et al., 1985]. Иммунохимия молекулы FL-AFP обнаружила кластеры из пяти основных антигенных эпитопов и одного скрытого эпитопа, который и позволяет молекуле переходить в другие формы. Помимо этого, было показано, что FL-AFP способна димеризоваться с ретиноевыми ядерными рецепторами, транскрипционными факторами и каспазами, образуя гетеродимеры [Li, Alexander, 2009]. Известно, что дефицит каспазы приводит к росту опухолевых клеток. Вероятно, такие переходные варианты молекулы АФП могут образовываться после инъекции FL-AFP пациентам, что может привести к аберрантной передаче сигнала АФП, а это, в свою очередь, может способствовать несвоевременному торможению и/или усилению роста клеток.

Молекула FL-AFP имеет большое количество пептидных сайтов связывания, некоторые из них могут быть неактивны до тех пор, пока AFP не будет введен в резко меняющееся биохимическое или биофизическое микроокружение [Mizejewski, 2009]. После такой стимуляции рецепторов биологический ответ, вызванный этими взаимодействиями, довольно трудно предсказать, а тем более контролировать, поэтому он может привести к нежелательным последствиям. Именно по этой причине еще в 1971 г. FDA (США) запретило продажу и распространение реагентов для иммуноанализа, содержащих молекулу AFP человека. Целесооб- разнее всего перед применением АФП было бы исключить наличие онкологии, за исключением тех случаев, когда АФП применяется в качестве молекулы, транспортирующей токсин [Mizejewski, 2011].

Благодаря иммуномодулирующим свойствам АФП и его основной функции – переноса низкомолекулярных веществ, его применение в терапии ряда патологических состояний является возможным. Таким образом, исходя из вышесказанного, следует, что изучение механизмов действия АФП на уровне иммунной системы на настоящий момент является актуальным вопросом.

Работа поддержана грантом РФФИ 19-415590001.