Применение бетулина в экспериментальных условиях при микоплазмозе, микоплазмоз-ассоциированной инфекции, цирковирозе и роже свиней

Микоплазмозы широко распространены в природе и являются важным этиологическим агентом в патологии респираторного и урогенитального тракта свиней [1]. Микоплазмоз – серьезная экономическая проблема современного животноводства. Болезнь протекает чаще всего в форме ассоциативных и смешанных инфекций.

Установлено, что причиной патологии сельскохозяйственных животных в большинстве случаев являются ассоциации микроорганизмов с участием условно патогенной микрофлоры, а также вирусов, хламидий и других патогенных микроорганизмов [2].

Основным фактором, обусловливающим патогенность микоплазм, является их способность прикрепляться к клеткам респираторного эпителия и оказывать на них деструктивное действие, а также выделять токсические продукты метаболизма, конкурировать с клетками хозяина за отдельные субстраты энергетического и белкового обмена и нарушать иммунологическое состояние тканей [3].

Микоплазмы способны преодолевать иммунный контроль и не вызывать повреждений тканей, связанных с иммунореактивностью макроорганизма. Однако при некоторых условиях микоплазмы могут вызывать в организме хозяина патологические изменения, часто осложня-

ющиеся иммунными расстройствами [4]. Внедрение микоплазм в клетку макроорганизма может приводить к изменению ее антигенной структуры, превращению ее в иммунологически чужеродную, что способствует развитию аутоиммунного процесса [5].

Микоплазмы вступают в синергические отношения с бактериальной, вирусной, патогенной и условно патогенной микрофлорой, создают условия для ее активного роста и развития. В связи с этим необходимо своевременно проводить диагностику, лечение и профилактику микоплазмоза, в том числе в ассоциации с другими возбудителями, с помощью современных и рациональных методов, принимая во внимание особенности течения и патогенез заболевания.

В комплексе лечебно-профилактических мероприятий при мультифакторных заболеваниях необходимо применение методов и средств, направленных на устранение иммунодефицитных состояний и повышение резистентности организма, а также средств, обеспечивающих экологическую и эпизоотологическую безопасность животных [6].

Бетулин – это природный пентациклический тритерпеноид лупанового ряда. Он содержится в большом количестве растений (орешник, календула, солодка и пр.), но в промышленных масштабах его получают экстракцией из бересты – наружного слоя коры березы белой (betula alba), повислой (betula pendula). В свободном виде вещество не встречается. Многочисленными исследованиями, проведенными более чем в 40 зарубежных и российских научноисследовательских центрах, продемонстрирована эффективность использования тритерпеновых соединений в качестве прямых регуляторов активности ферментативных систем организма. Тритерпеновый спирт управляет количеством ферментов в клетке организма путем регуляции их синтеза и распада и путем влияния на активность ферментов и их аллостерическую регуляцию [11].

Иммуностимулирующая активность бетулина проявляется в способности индуцировать выработку эндогенного интерферона в организме, а также повышать клеточный и гуморальный иммунитет, усиливать активность некоторых иммунокомпетентных клеток, в частности активизируя все показатели фагоцитоза (способность фагоцитов разрушать вирусы и бактериальные клетки), и увеличивать количество фагоцитов. Он является мощнейшим гепатопротектором. Бетулин – это антиоксидант с ярко выраженными желчегонными и бактерицидными свойствами. Также установлена его способность успешно противостоять различного рода новообразованиям, мутациям, токсинам (в основном вызванным неконтролируемым приемом фармакологических средств).

Препараты бетулина: «Бетулин-экстракт» (БЭ) для перорального применения и растворимая форма «Бетулин-ЭПГ» для парентерального применения – с положительным результатом были испытаны на лабораторных животных, птице, телятах и северных оленях [6–10].

Цель данной работы – разработать методы лечения при микоплазмозе и микоплазмоз-ассоциированной инфекции свиней и способы повышения напряженности поствакцинального иммунитета против рожи и цирковироза с применением бетулина.

Объекты и методы

Объектом исследования были свиноматки и поросята. Материалом для исследований служили пробы сыворотки крови, цервико-вагинальной слизи, носовых истечений, фекалий из прямой кишки. Для диагностики использовали эпизоотологический, клинический и лабораторный методы. Для индикации и идентификации возбудителей применяли серологические и бактериологические методы. Для выявления сывороточных антител крови, тканевых «местных» или локальных антител, а также антигенов возбудителей инфекционных болезней использовали реакцию непрямой (РНИФ) и прямой (РПИФ) иммунофлуоресценции. В качестве антигенов применяли: антигены вакцинных штаммов и стандартные антигены, используемые для постановки РА и РСК, а в качестве антител – гомологичные антигенам кроличьи и свиные антисыворотки, антивидовые для РНИФ и специфические сальмонеллезные, листериозные для РПИФ, люминесцентные сыворотки меченные ФИТЦ (ИЭМ им. Гамалеи).

Исследования микропаразитоценоза животных проводили, используя разработанные совместно с ФГУ «Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора» жидкие и твердые питательные среды для индикации и идентификации аргининзависимых (А), глю-козферментирующих (Г), микоплазм и уреаплазм (У), адаптированные для диагностики микоплазмоза у свиней [9], а также серологический метод с помощью РНИФ, в которой применяли полученные видоспецифические микоплазмозные сыворотки: M. hyosinoviae, M. hyorhinis, Ureaplasma sp. (Красиков А.П., Жонголович А.Е., патент № 2355422). Инкубацию посевов на питательных средах проводили при температуре 37 ºС в течение 48–96 ч, учет роста оценивался визуально по изменению цвета жидких и характерному росту колоний на плотных средах в виде глазуньи. Исследования сыворотки крови, влагалищной, носовой слизи, фекалий проводили до и через 14 дней после санации животных.

Эффективность лечения оценивали по отсутствию гибели животных, клинических признаков болезни, возбудителей и их антигенов в цервико-вагинальной, носовой слизи и фекалиях.

Для изучения иммуностимулирующих свойств препарата «Бетулин-ЭПГ» свиньям 1-й, 2-й опытных групп прививали живую, сухую вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2, а свиньям 3-й, 4-й групп – вакцину против цирковироза (цирковирусной инфекции) согласно наставлениям по их применению. Одновременно с применением вакцины животным 1-й и 3-й опытных групп вводили Бетулин-ЭПГ подкожно в дозе 0,2 мл/кг массы.

Кровь для исследования в РНИФ брали из ушной вены в различные периоды: до введения препарата и вакцинации, затем на 7, 15, 30, 60-й день после вакцинации. Иммунологические исследования проводили при высоком уровне антител на 15-й день после вакцинации. Число Т-лимфоцитов определяли с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-рок); Т-киллеров – непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-рок); В-лимфоцитов – комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка. Функциональную активность нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте: спонтанном без нагрузки и стимулированном с использованием антигена БЦЖ с последующей фиксацией реакции с помощью многоканального иммунохимического анализатора «Fluorofot STDLess-486-М». Оценку концентрации образовавшегося диформазана (ДФ) в нейтрофилах определяли при λ = 630 нм. Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом осаждения полиэтиленглюколем (ПЭГ-6000) с последующим фотометрическим определением оптической плотности образовавшегося преципитата на многоканальном иммунохимическом анализаторе при λ = 450 нм. Окраску мазков крови, подсчет лейкоцитов и выведение лейкоцитарной формулы проводили по общепринятым методикам. Уровень специфических антител в сыворотке крови определяли в РНИФ.

Результаты исследований

Опыт, проведенный на свиноматках и поросятах ЗАО «Кам-Курское» Муромцевского района Омской области, показал, что при микоплазмозе и микоплазмоз-ассоциированной инфекции эффективность клинического и микробиологического выздоровления взрослых свиноматок и поросят с применением Левотетрасульфин-ПЭГ в сочетании с Бетулин-Э составила 100%, одного Левотетрасульфин-ПЭГ – 40 % у свиноматок и 60 % у поросят (табл. 1, 2). Бету-лин-Э в сочетании с Левотетрасульфин-ПЭГ купирует симптомы поражения органов дыхания (отек носовых ходов, уменьшение количества бронхиальной слизи, кашель) и опорнодвигательной системы быстрее, чем при использовании одного Левотетрасульфин-ПЭГ. Это объясняется противовоспалительными свойствами данного препарата.

Таблица 1

Схема опыта и эффективность лечения свиноматок при микоплазмозе и микоплазмоз-ассоциированной инфекции

Кол-во голов	Характеристика группы	Эффективность лечения
		Клиническое выздоровление, кол-во/%	Микробиологическое выздоровление, кол-во/%
1-я опытная группа: хламидии + микоплазмы (А, Г)
5 1	Левотетрасульфин-ПЭГ+бетулин	5/100             1	5/100
2-я опытная группа: микоплазмы (А, Г) + уреаплазмы
5 1	Бетулин	5/100             1	3/60
3-я опытная группа: микоплазмы (А, Г) + уреаплазмы + лептоспиры
5	Левотетрасульфин-ПЭГ + бетулин	5/100             1	5/100
4-я опытная группа: микоплазмы (А, Г) + уреаплазмы + лептоспиры
5 1	Левотетрасульфин-ПЭГ	5/100             1	2/40
5-я контрольная группа (нелеченые): микоплазмы (А, Г) + уреаплазмы + лептоспиры + хламидии
5		0/0                 1	0/0
5	6-я контрольная группа (здоровые животные)

После проведенного лечения во влагалищной слизи свиноматок, носовой слизи и фекалиях поросят отсутствовали возбудители хламидиоза, лептоспироза и микоплазмоза. В опытной группе, где вместо Бетулин-Э применяли Бициллин-3 (метод лечения, применяющийся в хозяйстве), выделяли лептоспир у свиноматок и лептоспир с пастереллами у поросят, а в контрольной группе обнаруживали возбудителей хламидиоза, лептоспироза, микоплазмоза и уреаплаз-моза. В опытной группе, где применяли только Бетулин-Э, процент выздоровления свиноматок составил 60 %, поросят – 80 %. Эти результаты свидетельствуют о противомикробном действии Бетулин-Э.

Таблица 2

Схема опыта и эффективность лечения поросят при микоплазмозе и микоплазмоз-ассоциированной инфекции

Кол-во голов	Характеристика группы	Эффективность лечения
		Клиническое выздоровление, кол-во/%	Микробиологическое выздоровление, кол-во/%
1-я опытная группа: микоплазмы (А, Г)
5     Левотетрасульфин-ПЭГ + бетулин		5/100               1	5/100
2-я опытная группа: микоплазмы (А) + хламидии
5     Бетулин		5/100               1	4/80
3-я опытная группа: микоплазмы (А, Г) + хламидии + лептоспиры
5     Левотетрасульфин-ПЭГ + бетулин		5/100               1	5/100
4-я опытная группа: микоплазм ы (А, Г) + пастереллы + лептос пиры
5     Левотетрасульфин-ПЭГ		5/100               1	3/60
5-я контрольная группа (нелеченые): микоплазмы (А, Г) + лептоспиры + хламидии
5 1		0/0                   1	0/0
6-я контрольная группа (здоровые животные)

В контрольных несанированных группах у свиноматок и поросят через 14 дней после начала опыта естественная инокуляция возбудителей из организма не произошла.

Использование на свиноматках и поросятах Бетулина-Э внутрь при микоплазмозе и ми-коплазмоз-ассоциированной инфекции в экспериментальных условиях способствует выздоровлению 60 и 80 % животных, а при его сочетанном применении с комплексным антимикробным препаратом Левотетрасульфин-ПЭГ усиливаются терапевтические свойства последнего на 40 и 20 % соответственно, что позволило в более ранние сроки купировать инфекционный процесс у животных опытных групп и обеспечило их полное клиническое и микробиологическое выздоровление (табл. 1).

При изучении иммуномодулирующих свойств препарата «Бетулин-ЭПГ» в производственном контролируемом опыте, проведенном в условиях СТФ «Новоазовское» Азовского района Омской области, установлено, что на 15-й день после вакцинации в опытных группах, где применяли Бетулин-ЭПГ, количество Т-лимфоцитов на 19 и 23 % соответственно выше, чем в группах, где использовали только вакцину. Вероятно, после контакта с антигеном лимфоциты начинают активно размножаться, количество их достоверно увеличивается (Р < 0,05). Достоверным было количество В-лимфоцитов в крови поросят опытной группы на 16% ниже. По-видимому, это связано с их активной трансформацией в плазматические клетки и активизацией синтеза антител. Снижение ЦИК объясняется усилением фагоцитоза. Макрофаги активнее фагоцитируют комплекс «антиген – антитело», чем только антиген. Кроме этого регистрируется достоверное уменьшение количества Т-киллеров (Р < 0,05) и нейтрофилов (Р < 0,001). В опытных вакцинированных группах с применением Бетулин-ЭПГ (по сравнению с невакци-нированными) количество нейтрофилов снизилось (Р < 0,001) на 89 %, а в группах, где применяли только вакцины, – на 79 %. Первый этап воспалительной реакции характеризуется резким уменьшением в кровотоке числа нейтрофилов, которые мигрируют в регионарные лимфоузлы и очаг воспаления в месте введения вакцины. Нейтрофилы начинают активный процесс фагоцитоза чужеродных клеток. Лимфоциты, мигрировавшие в очаг, на первом этапе реакции активизируют фагоцитарную функцию нейтрофилов. Активность естественных киллеров, мигрировавших в очаг, усиливается антителами, специфически и неспецифически сорбирующимися на чужеродных клетках. При этом титр поствакцинальных антител после применения Бетулина-ЭПГ у свиней был в 4 раза выше, чем на одну вакцину (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика группы	7-й день	15-й день	30-й день	60-й день
1. Вакцина против рожи свиней + Бетулин-ПГ	1:320	1:640	1:640	1:640
2. Вакцина против рожи свиней	1:80	1:160	1:160	1:80
3. Вакцина против цирковирусной инфекции свиней + Бетулин-ПГ	1:400	1:800	1:80	1:40
4. Вакцина против цирковирусной инфекции свиней	1:100	1:20	1:20	1:10

Показатели поствакцинального иммунного ответа у свиней

Заключение

Использование на свиноматках и поросятах Бетулин-Э внутрь при микоплазмозе и мико-плазмоз-ассоциированной инфекции в экспериментальных условиях способствует выздоровлению 60 и 80 % животных, а при его сочетанном применении с комплексным антимикробным препаратом «Левотетрасульфин-ПЭГ» усиливает терапевтические свойства последнего на 40 и 20 % соответственно, что позволило в более ранние сроки купировать инфекционный процесс у животных опытных групп и обеспечило их полное клиническое и микробиологическое выздоровление. Препарат «Бетулин-ЭПГ» в 4 раза увеличивает уровень поствакцинальных антител против цирковироза и рожи свиней, повышает функциональную активность иммунокомпетентных клеток крови, прежде всего за счет активации нейтрофилов.