Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфицированности крупного рогатого скота вирусом лейкоза

Хроническое заболевание опухолевой природы, вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) (1), наносит большой ущерб скотоводству в связи со снижением продуктивности больных животных, выбраковкой зараженных и больных особей, ограничением срока хозяйственного использования, а также затратами на проведение оздоровительных мероприятий. Борьба с лейкозом крупного рогатого скота основывается на диагностике вируса и постепенной элиминации зараженных животных. Однако при высокой инфицированности скота, превышающей 70 %, наиболее рациональным было бы использование специфических вакцин. Однако многочисленные попытки по созданию эффективных вакцин для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и предотвращения развития опухолевых процессов пока не привели к желаемым результатам.

ВЛКРС — онкогенный ретровирус, вызывающий В-клеточный лимфоцитоз, лейкемию и лимфосаркому у овец и крупного рогатого скота. ВЛКРС имеет 50 % сходство с вирусом Т-клеточной лейкемии человека типа I и II (2). В-клетки являются первичными мишенями для ВЛКРС (3). Инфицированность животных не всегда приводит к развитию заболевания; для этого необходимо определенное состояние иммунной системы и генетическая восприимчивость особей к заболеванию. Вирус индуцирует хроническую инфекцию у крупного рогатого скота, приводящую к трем возможным патологическим формам заболевания: асимптоматическое течение, персистентный лимфоцитоз и лимфосаркома, которая встречается довольно редко.

Естественным хозяином ВЛКРС в природе является крупный рогатый скот. В эксперименте этим вирусом можно инфицировать овец, коз, свиней, обезьян и кроликов. При заражении ВЛКРС животные могут быть вирусоносителями иногда на протяжении всего периода использования, но лишь в 5-10 % случаев развивается лейкоз. При изучении вирусной этиологии лейкоза накоплены данные, свидетельствующие о генетически обусловленной устойчивости животных отдельных пород и линий к ВЛКРС. Однажды инфицированное животное остается вирусоносителем в течение всей жизни; возбудитель передается с кровью, молоком, носовой и влагалищной слизью. Возможны два пути заражения — вертикальный (от матери плоду) и горизонтальный (от зараженного животного здоровому). К сожалению, следует отметить возможность передачи инфекции при проведении ветеринарных мероприятий в случае не соблюдения мер по использованию одноразовых или стерилизованных медицинских инструментов.

Показано, что устойчивость к лейкозу контролируется геном главного комплекса гистосовместимости BoLA-DRB3 (4, 5). Выявлена взаимосвязь между аллелями этого гена и продуктивностью животных: высокопродуктивные особи в большей степени подвержены заболеванию лейкозом, чем низкопродуктивные.

Изучение ассоциативных связей между генами главного комплекса гистосовместимости у крупного рогатого скота BoLA (bovine leukocyte antigens) и устойчивостью к лейкозу позволило идентифицировать аллели гена BoLА-DRB3. Например, у черно-пестрого скота три (BoLA-DRB3.2*11, BoLA-DRB3.2*23, BoLA-DRB3.2*28) и четыре (BoLA-DRB3.2*8, BoLA-DRB3.2*16, BoLA-DRB3.2*22 и BoLA-DRB3.2*24) аллеля гена BoLА-DRB3 контролируют соответственно невосприимчивость и восприимчивость к лейкозу, причем первые доминируют над вторыми. Пока- зано, что спектр аллелей гена BoLA-DRB3 универсален и определяется короткими аминокислотными мотивами в позициях антигенов 74-78 и 70-71 (4-7). Удалось выявить дополнительные аллели гена BoLA-DRB3 (5). Установлено, что у вирусоносителей, больных и здоровых коров различных пород уровень гетерозиготности по гену Bo-LA-DRB3 выступает в качестве неспецифического фактора устойчивости к лейкозу (5, 7).

Одним из подходов к оздоровлению стад может служить селекция на повышение устойчивости к лейкозу. Для этого необходима своевременная и точная диагностика заболевания. Основной диагностический метод, по результатам которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, — реакция иммунодиффузии (РИД) в агарозном геле с использованием гликопротеидного антигена ВЛКРС.

Метод РИД основан на обнаружении в сыворотке крови исследуемых животных специфических преципитирующих антител к антигенам ВЛКРС, появляющихся в крови через 1,5-2 мес после заражения и сохраняющихся пожизненно. Метод обладает высокой специфичностью, простотой постановки, низкой себестоимостью, но довольно низкой чувствительностью. Одним из недостатков является также невозможность выявить всех зараженных животных и исследовать молодняк до 6-месячного возраста.

При использовании иммуноферментного анализа (ИФА) применяют антивидовой конъюгат с ферментами-маркерами. По сравнению с РИД метод ИФА является более чувствительным и специфичным, что позволяет автоматизировать процесс и сократить время анализа. Разработан метод ИФА с применением моноклональных антител.

Животных, в сыворотке крови которых методами РИД и ИФА обнаружены специфические антитела к ВЛКРС, подвергают гематологическому исследованию и выявляют среди вирусоносителей больных особей.

К числу современных методов диагностики многих инфекций, в том числе и лейкоза, относятся молекулярная гибридизация (7) и полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанные на обнаружении ДНК возбудителя в организме животных. Эти методы обладают максимальной чувствительностью и высокой специфичностью и позволяют выявить вирус уже через 1 нед после заражения. В настоящее время программы оздоровления хозяйств от лейкоза построены на применении в качестве диагностики метода РИД: серопозитивных животных считают зараженными и выводят из стада. При таком подходе оздоровление стада затягивается на годы, так как невозможно обнаружить всех инфицированных животных (особенно на ранних стадиях) и изолировать их от здоровых. Метод ПЦР позволяет выявлять инфицированных животных в раннем возрасте — 15 сут.

В связи с этим в задачу нашей работы входила оценка эффективности двух методов диагностики лейкоза у крупного рогатого скота — РИД и ПЦР.

Описание методики . Объектом исследования служили животные чернопестрой породы голландской селекции (I выборка, n = 51) из ЗАО «Авангард» (Рязанская обл.) и улучшенной черно-пестрой породы (II выборка, n = 35) с зоостанции Московской сельскохозяйственной академии (МСХА) им. К.А. Тимирязева.*

ДНК выделяли из цельной крови с использованием набора реагентов DIAtom DNA Prep (фирма «IsoGene», Москва), согласно прописи производителя. Для обнаружения ВЛКРС использовали набор реагентов «GenPak™ proBLV » для амплификации фрагмента гена gag в ДНК провируса на основе ПЦР (изготовитель Г.О. Шайха-ев, фирма «IsoGene», Москва). Полимеразную цепную реакцию ставили в термоциклере Amply 4L (фирма «Biokom», Москва) в следующем режиме: первый цикл — денатурация ДНК 120 с при 95 ^оС, отжиг праймеров 60 с при 62 ^оС, элонгация 120 с при 74 ^оС; второй цикл — денатурация ДНК 60 с при 95 ^оС, отжиг праймеров 50 с при 60 ^оС, элонгация 60 с при 74 ^оС; 43 цикла — денатурация 60 с при 95 ^оС, отжиг праймеров 40 с при 58 ^оС, элонгация 60 с при 74 ^оС; заключительный цикл — элонгация 120 с при 74 ^оС. Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и тестировали под УФ-лучами в трансиллюминаторе.

В I и II выборках методом ПЦР было выявлено соответственно 60,3 и 5,7 % инфицированных коров, а методом РИД — 44,2 и 0 %.

На зоостанции МСХА ежегодно проводят мероприятия по диагностике лейкоза методом РИД с последующей немедленной выбраковкой инфицированных животных, а также зоогигиенические мероприятия, исключающие передачу вируса от зараженных животных здоровым. Несмотря на это, методом ПЦР во II выборке выявлено 5,7 % инфицированных животных.

Для оценки эффективности диагностики ВЛКРС методами РИД и ПЦР мы провели более детальный анализ коров I выборки. При этом методом ПЦР было идентифицировано на 18 % больше инфицированных особей по сравнению с таковыми при использовании РИД. Это закономерно, так как метод РИД позволяет выявить носителей инфекции, у которых ВЛКРС присутствует в виде провируса при отсутствии антител. Однако методом РИД обнаружено три инфицированных коровы (1,9 %), у которых при повторном типировании ВЛКРС методом ПЦР не выявлен вирус. Тем не менее возможно и другое объяснение, например, низкий титр прови-русной ДНК, недостаточный для выявления ВЛКРС методом ПЦР. Эти данные свидетельствуют о важности РИД-диагностики ВЛКРС для отдельных животных.

Итак, использование метода ПЦР-диагностики ВЛКРС позволит значительно повысить эффективность и темпы проведения мероприятий по оздоровлению стад крупного рогатого скота от лейкоза.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    B u r n y A., C l e u t e r Y., K e t t m a n n R. e.a. Bovine leukemia: facts and hypotheses derived from the study of an infection cancer. Vet. Microbiol., 1988, 17: 197-218.

• 2.    S a g a t a N., Y a s u n a g a T., T s u z u k u - K a w a m u r a J. e.a. Complete nucleo- tide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to other retroviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 677-681.

• 3.    E s t e b a n E.N., T h o r n R.M., F e r r e r J.F. Characterization of the blood lymphocyte population in cattle infected with the bovine leukemia virus. Cancer Res., 1985, 45: 3225-3230.

• 4.    X u A., V a n E i j k M.J.T., P a r k C. e.a. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis by bovine leukemia virus. J. Immunol., 1993, 151: 6977-6985.

• 5.    У д и н а И.Г., К а р а м ы ш е в а Е.Е., Т у р к о в а С.О. и др. Генетические механизмы устойчивости и чувствительности к лейкозу айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота, установленные на основе распределения аллелей гена BoLA-DRB3 . Генетика, 1995, 31: 1294-1299.

• 6.    У д и н а И.Г., К а р а м ы ш е в а Е.Е., С у л и м о в а Г.Е. и др. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости. Генетика, 1998, 34: 1668-1674.

• 7.    М а л ь ц е в а Н.А., К а л е д и н А.С., О л и й н и к Е.И. и др. Использование диагностических ДНК-зондов для обнаружения пpовиpуса вируса бычьего лейкоза у инфицированных коров. Вопр. вирусол., 2002, 6: 38-42.

* Образцы крови и результаты диагностики инфицированности ВЛКРС методом РИД любезно предоставлены ветеринарами ЗАО «Авангард» и зоостанции МСХА им. К.А. Тимирязева.

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН ,            Поступила в редакцию 3

119991, Москва, ул. Губкина, 3;                                             мая 2005 года

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, Москва;

ЗАО «Авангард», Рязанская обл.

APPLICATION OF PCR METHOD FOR DIAGNOSTICS

OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS IN CATTLE

I.G. Udina, I.N. Falynskova, A.S. Trukhin

S u m m a r y

Bovine leukemia virus (BLV) infection was studied in two cattle herds of Black Pied breed. Efficiency of two methods of diagnostics RID (reaction of immune diffusion) and PCR were compared. High efficiency of PCR method compared to RID was detected, because PCR method allowed us additionally reveal 18 % of infected cows.

Новые книги

А б о н е е в В.В., Ч и ж о в а Л.Н., С е л и о н о в а М.И. Иммуногенетика в селекции овец . Ставрополь, 2004, 168 с.

В монографии обобщены данные литературы и результаты многолетних исследований сотрудников лаборатории иммуногенетики Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства по использованию иммуноге-нетических методов в селекции овец. Описаны технология приготовления и условия хранения моноспецифических сывороток. Приведены примеры использования методов статистического анализа иммуногенетических данных в селекционно-пле-менной работе. Обсуждаются результаты использования методов иммуноге-нетического анализа в генетике и селекции овец. Представлен словарь селекционно-генетических терминов. Рассматриваются наследственно детерминированные полиморфные системы белков и ферментов крови овец. Проанализирована возможность использования генетически обусловленных систем антигенов групп крови, белков и ферментов в селекции овец. Уделено внимание методам определения достоверности происхождения животных и оценки препотентности баранов-производителей по продуктивным качествам их дочерей.

А й б а з о в М.М., А б о н е е в В.В., С е л и о н о в а М.И. Биотехнология воспроизводства овец и коз. Ставрополь, 2004, 330 с.

В монографии обобщены данные отечественной и зарубежной литературы, а также приведены результаты собственных исследований авторов по проблемам биотехнологии воспроизводства овец и коз. Описано анатомическое строение половых органов самцов и самок и способы хранения спермы баранов и козлов. Рассматривается нейрогуморальная регуляция воспроизводительной функции животных. Освещены вопросы биохимии и физиологии криоконсервированной спермы. Обоснована целесообразность сохранения генетического разнообразия животных. Предложены оптимальные технологии организации осеменения овец и коз, рационального использования высокопродуктивных производителей и маток. Уделено внимание регулированию воспроизводительной функции овец и коз, а также методам создания трансгенных животных. Изложены проблемы сохранения генофонда высокопродуктивных животных, редких и исчезающих пород и популяций. Описана технология внут-риматочного осеменения овец с использованием метода лапароскопии.