Применение методов молекулярного маркирования для оценки сортовых качеств семян простых гибридов подсолнечника

Сортовые качества семян – первостепенный вопрос, в равной степени волнующий как продавцов, так и покупателей семян. Первые заинтересованы в том, чтобы дороже продать семена, а для этого они должны быть уверены в их чистосортности. Вторые, купив элитные или репродукционные семена, вправе рассчитывать на получение высоких урожаев.

Для так называемых «гетерозисных» культур, таких как гибридный подсолнечник, чисто-сортность семян (уровень гибридности) особенно важна, так как в данном случае урожай напрямую зависит от процента гибридных семянок в реализуемой партии семян. Традиционно этот процент определяют методами грунт-контроля и апробацией посевов.

В условиях жесткой конкуренции на современном рынке семян, прежде всего гибридных, требования к их качеству сильно возрастают.

При оценке сортовых качеств семян сельскохозяйственных растений Закон о семеноводстве предусматривает также проведение лабораторного контроля, которым, к сожалению, часто пренебрегают, в частности, и при проведении их сертификации. Однако существует ряд причин, по которым лабораторный контроль (различные методы электрофореза)

бывает единственным методом, позволяющим быть уверенным в чистосортности покупаемых (продаваемых) семян:

• - апробация не всегда может дать реальное представление о чистосортности посевов в силу фенотипического сходства многих из них, а также гарантировать сортовую чистоту семян на конечном этапе, когда они готовы к реализации;

• - из-за возможных нарушений технологической дисциплины при уборке, транспортировке, сушке и сортировке семян (неочищенные от предыдущих партий семян машины и механизмы и т.д.) чистосортность посевов в поле и семян, готовых к реализации, могут существенно различаться.

• - в случае необходимости быстрой проверки семян на сортовую принадлежность и сортовую чистоту, например, при торговых операциях, методы апробации и грунтового контроля не могут быть использованы [1].

При определении уровня гибридности семян F 1 гетерозисных культур (например, подсолнечник, кукуруза) использование перечисленных выше методов вообще малоэффективно из-за их сезонности и длительности и может давать информацию скорее констатирующую, чем упреждающую.

В мировой и отечественной практике производства семян возникали прецеденты, когда без лабораторных методов нельзя было установить сортовую принадлежность и чистоту семян. Кроме того, лабораторный контроль способен быть эффективным инструментом при арбитражных разбирательствах.

Одна из наиболее информативных ДНК-систем молекулярного маркирования сельскохозяйственных культур – так называемые микросателлитные последовательности ДНК (SSR).

Микросателлитные последовательности распространены повсеместно в ДНК высших растений. Они были обнаружены у 34 видов.

Источник полиморфизма этих последовательностей – в сайт-специфическом варьировании длины повтора, что в свою очередь обусловлено различием в числе единиц повтора [2].

SSR -маркеры стабильны в соматических клетках, локусспецифичны, их наследование как правило носит кодоминантный характер, что позволяет отличать гомозиготное состояние от гетерозиготного, распределение по всему геному облегчает использование этих маркеров как для молекулярного картирования генома, так и для выполнения целого ряда прикладных селекционногенетических задач.

Целью данной работы была оценка уровня гибридности (процент гибридных семянок) простых гибридов подсолнечника на основе ПЦР (микросателлитного) анализа.

В рамках поставленной цели была также выполнена оптимизация условий ПЦР для использованных в работе микросателлитных маркеров и проверен полиморфизм этих микросателлитных локусов между 7-ю инбредными линиями подсолнечника – родительскими формами при создании простых гибридов.

Материалы и методы. Сортовую чистоту (уровень гибридности ) простых гибридов подсолнечника с использованием ПЦР (микросателлитных) маркеров изучали посеменным микроса-теллитным анализом (по 100 семянок) районированных на территории Краснодарского края гибридов Агафья, Светлана и Махаон.

Полиморфизм микросателлитных локусов проверяли на 7 инбредных линиях, часть из которых использована для создания указанных гибридов.

При этом использовали полиморфизм 5 микросателлитных локусов ( gov.):

Ha 514-ar F- GGTCAACGGATTTAGAGTC,

R- GTATTGATTCCAACATCCAG;

Ha 1287-ar F- GATATGAGCCCATCACTCATC ,

R- GAAGATATGTCAGGTCACACCC;

Ha 1442-ar F- GCTTATGTGCTTACGTGTTCCTG,

R- CTAAACAGTTCGGCGAGTGTAGG;

Ha 1608-ar F- GATCTTAGGTCCGCCAC,

R- GATGGCATTTGGCTAGAC;

Ha 1796-ar F- CGAAGGAAGGAACCTGCCTC,

R- CCATACGCGTTTACTTCTCAGG;

Ha 1327-ar F- CCGTTAGGTATGTTACTTGCGACC

R- GGTGGGGGGAATATTCTGAGGTG

Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод [3].

• ПЦР проводили в реакционном объеме 25 мкл в ДНК-амплификаторе «Терцик» (производство комп. «ДНК-технологии», г. Москва);

ПЦР-смесь включала: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5-3,0 мM MgCl 2 ; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 единицу рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы.

Параметры ПЦР:

• 5 минут при 94 ^оС – начальная денатурация.

Следующие 35 циклов:

• 30 секунд денатурация при 94 ^оС;

• 30 секунд отжиг праймеров при N ^оС;

• 30 секунд синтез при 72 ^оС;

последний цикл синтеза 3 минуты при 72 оС, где N оС– оптимизированные нами температуры отжига:

52 оС для маркеров Ha 1608-ar, Ha 514-ar;

55 оС для маркера Ha 1287-ar;

57 оС для маркера Ha 1796-ar;

60-62 оС для маркеров Ha 1327-ar, Ha 1442-ar.

Продукты ПЦР-реакции разделяли электро-форезом в 8 %-ном полиакриламидном геле на основе 1×трис-боратного буфера (0,09 М трис, 0,09 М борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, рН 8,2).

Визуализация результата реакции амплификации проводилась с использованием бромистого этидия (BrEt, 2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенатридинийбромид, хомидий бромид). BrEt способен интеркалировать в двойную спираль ДНК, и при таком связывании усиливается флюоресценция в проходящем УФ свете.

Гелевые пластины помещали на 20-40 мин в раствор бромистого этидия (5мкг/мл) и фотографировали в УФ свете.

Результаты. Для оценки сортовых качеств семян (уровень гибридности) простых гибридов подсолнечника на основе применения ДНК-маркирования нами был использован полиморфизм микросателлитных локусов. Эта система молекулярного маркирования приоритетна, в частности, и для «гетерозисных» культур ввиду высокого уровня полиморфизма (25 и выше аллелей на один локус), локусспецифичности и кодоминантного характера наследования [4].

В частности, зарубежными авторами были созданы микросателлитные маркеры для изучения биоразнообразия подсолнечника [5].

Отечественные авторы также с успехом использовали микросателлитные маркеры для анализа 17 инбредных линий и гибридных комбинаций [6].

Нами первоначально был проверен полиморфизм использованных в работе маркеров между семью инбредными линиями, родительскими для оцениваемых в рамках исследования простых гибридов. Затем на основании полученной информации, проводился контроль уровня гибридности партий семян гибридов Агафья, Махаон и Светлана.

Семянки для исследования были взяты с участков гибридизации, где «отцовская форма» выкашивалась до созревания семян для исключения опасности засорения партий гибридных семян. Кроме того, соблюдалась пространственная изоляция посевов выращиваемых простых гибридов таким образом, чтобы до ближайшего поля, засеянного подсолнечником, расстояние было не менее трех километров.

Рисунок 1, например, иллюстрирует полиморфизм микросателлитных локусов НА 1796-ar и НА 1442-ar.

Рисунок аллельной миграции в локусе НА 1796-ar позволяет разделить изученные линии на две группы: первая группа – линии №№ 1, 3, 4, 6, 8; вторая группа – линии №№ 2, 5, 7.

Для маркера НА 1442-ar линии разделяются на следующие группы: первая группа – линии №№ 1, 3, 5, 8; вторая группа – линии №№ 2, 7; третья группа – линия № 4.

Маркеры, оказавшиеся полиморфными между родительскими линиями каждой анализируемой гибридной комбинации, были использованы для оценки уровня гибридности партий семян этой комбинации (рис. 2, 3, 4).

Рисунок 1 – Полиморфизм микросателлитных локусов НА 1796-ar и НА 1442-ar у 7-и инбредных линий подсолнечника

Рисунок 2 – Аллельная миграция в локусе НА 1327-ar у просто гибрида подсолнечника Агафья

Примечание: № 9, 10 – материнская и отцовская инбредные линии данного гибрида соответственно

Из рисунка 2 видно, что из 18 представленных на данной электрофореграмме семянок «отцовская» аллель в данном локусе присутствует у 8 (№№ 2, 3, 6, 7, 14, 17, 18, 20), которые, таким образом, являются гибридными. Остальные семянки несут только «материнскую» аллель и, следовательно, получены в результате самоопыления.

Рисунок 3 – Аллельная миграция в локусе НА 1796-ar у простого гибрида подсолнечника Светлана

Примечание: семян ки №№ 10 и 11 – материнская и отцовская инбредные линии данного гибрида соответственно

Из рисунка 3 видно, что из 17 проанализированных семянок 10 (№№ 4, 6, 9, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19) несут в данном локусе «отцовскую» аллель и, следовательно, имеют гибридное происхождение.

Рисунок 4 – Аллельная миграция в локусе НА 1796-ar у простого гибрида подсолнечника Махаон

Примечание: семянки №№ 10, 11 – материнская и отцовская инбредные линии соответственно, использованные для создания гибрида

Из рисунка 4 видно, что из 13 проанализированных семянок 11 (№№ 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14) несут «отцовскую» аллель и, следовательно, имеют гибридное происхождение.

Выводы. Таким образом, уровень полиморфизма системы молекулярного маркирования на основе микросателлитных локусов ДНК позволяет с успехом использовать ее как надежный лабораторный метод оценки сортовых качеств семян гибридного подсолнечника.