Применение модифицированного метода Фолина-Чокальтеу для оценки антиоксидантной емкости эмульсионных растительных напитков с добавлением кофе

A.V. Tarasov, , N.V. Zavorokhina®, , Ural State University of Economics, Ekaterinburg, Russia

Многочисленные исследования продемонстрировали связь между употреблением в пищу растительных полифенолов и здоровьем человека [1–4]. Ярким примером является средиземноморская диета, в которой основными источниками полифенолов служат орехи, чай, кофе, фрукты, овощи, шоколад, красное вино и макароны [2], употребление которых имеет обратную связь с риском сердечнососудистых заболеваний [3] или общей смертностью [4]. Рынок продовольственных товаров на основе растительного сырья интенсивно развивается. В последнее время представлены эмульсионные растительные напитки, которые в коммерческих и маркетинговых целях были названы «растительным молоком», «альтернативным молоком», «заменителями молока» или даже «аналогами молока» [5–8]. Эти напитки представляют собой суспензии злакового, зернобобового или орехового сырья в воде и по внешнему виду напоминают коровье молоко. Пищевые и функциональные свойства зависят от используемого растительного сырья, обработки и обогащения. Эмульсионные растительные напитки рекомендуются для вегетарианского питания, при непереносимости лактозы, аллергии на коровье молоко и гиперхолестеринемии. Сообщалось, что органолептическая приемлемость данных напитков может ограничивать их популярность [5, 6]. Данные по влиянию употребления эмульсионных растительных напитков в краткосрочной и долго- срочной перспективе на здоровье человека отсутствуют [7]. С одной стороны, органолептические, питательные и функциональные свойства растительных «заменителей молока» могут быть улучшены в результате ферментации [8]. С другой стороны, взаимодействия полифенолов с белками, липидами и углеводами пищевых систем могут влиять на биоактивность и биодоступность первых [9].

Растительные полифенолы насчитывающую более 9000 соединений, что затрудняет оценку их индивидуального содержания в продуктах питания [10]. Спектрофотометрический анализ Фолина-Чокальтеу является хорошо известным методом определения общего содержания полифенолов, который был предложен в 1965 году и с тех пор получил большое распространение [11]. Этот метод был одобрен Международной Ассоциацией официальных агрохимиков [12], а также был стандартизирован Международной организацией по стандартизации (ISO 14502-1:2005) и Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии России (ГОСТ Р ИСО 14502-1–2010) для определения общего содержания полифенолов в чае. Однако реагент Фолина-Чокальтеу неспецифичен для фенольных соединений и способен окислять аминокислоты, пептиды, белки, редуцирующие сахара, ароматические амины, тиолы, аскорбиновую, мочевую и олеиновую кислоты, а также некоторые пищевые добавки (сульфиты, нитриты, соли железа (II), марганца (II) и другие) [11, 13, 14]. Как следствие, метод Фо-лина-Чокальтеу требует предварительного удаления мешающих веществ из анализируемого образца или введения поправки на их присутствие. В противном случае анализ Фо-лина-Чокальтеу не может рассматриваться в качестве стандартного метода определения общего содержания полифенолов, но может быть использован для оценки антиоксидантной емкости (АОЕ). Обычный метод Фолина-Чокальтеу оказался неприменим для жирорастворимых антиоксидантов, что побудило исследователей разработать модифицированный анализ для одновременного измерения гидрофильных и липофильных антиоксидантов [15]. В этой работе мы применили модифицированный метод Фолина-Чокальтеу в определении АОЕ эмульсионных растительных напитков в том числе с добавлением с кофе с целью оценки возможного влияния на функциональные свойства кофейного напитка.

Объекты и методы исследований

Объекты исследования . Следующие эмульсионные растительные напитки российского производства служили объектами исследования: напитки Nemoloko овсяные жирностью 0,5, 1,5, 3,2 и 12 % (ОАО «Сады При-донья»); напитки «Здоровое меню» овсяный, рисовый и соевый жирностью 1 % (ООО «Объединение «Союзпищепром»); напиток Alpro миндальный жирностью 1,1 % (АО «Данон Россия»). Критерием включения напитков в исследование было наличие одной растительной основы. Молоко коровье ульт-рапастеризованное Parmalat жирностью 1 % (АО «Белгородский молочный комбинат», Россия) было проанализировано в сравнительных целях. Кофейный напиток был приготовлен путем добавления 100 мл горячей (100 °С) дистиллированной воды к 6 г молотого среднеобжаренного кофе «Жокей классический» (ООО «Орими», Россия) с последующей фильтрацией через бумажный фильтр «черная лента». Все напитки были приобретены в розничной торговой сети. Витамин B₁₂ (ОАО «Дальхимфарм», Россия) и витамин D 3 (ООО «Мирролла», Россия) были приобретены в розничной аптечной сети и проанализированы в качестве потенциально мешающих веществ.

Методы исследования . Определение АОЕ выполняли спектрофотометрическим методом Фолина-Чокальтеу с использованием оригинальной и модифицированной методик анализа. Измерение поглощения проводили на спектрофотометре Ecoview UV-1200 (Shanghai Mapada Instruments Co., Ltd., Китай) при использовании кварцевых кювет с длиной оптического пути 10 мм. Оригинальный анализ Фолина-Чокальтеу выполняли в соответствии с ГОСТ Р ИСО 14502-1–2010. Модифицированный анализ Фолина-Чокальтеу выполняли по методике [15]. В последнем случае реагент Фолина-Чокальтеу (2 н) разбавляли изобутиловым спиртом (99 %) в соотношении 1:2 по объему, т. е. один объем реагента Фолина-Чокальтеу смешивали с двумя объемами изобутанола. Исследуемые образцы разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:9 по объему. К 0,3 мл реагента Фолина-Чокальтеу (1:2) добавляли 0,2 мл образца (1:9) и 3,5 мл раствора гидроксида натрия (0,1 М), доводили объем в пробирке дистиллированной водой до 10 мл и перемешивали ее содержимое. Полученную реакционную смесь

Фолина инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и затем измеряли оптическую плотность при 665 нм относительно холостой пробы, которая содержала ацетон (99 %) вместо образца. Линейная калибровочная кривая y = 0,0018x – 0,0444 (R2 = 0,9987) была получена в аналогичных условиях для водных растворов галловой кислоты 50, 100, 200, 300 и 400 мг/л. АОЕ в миллиграмм-эквивалентах галловой кислоты в 1 л образца (мг-экв ГК/л) рассчитывали по калибровочной кривой с учетом 10-кратного разбавления пробы. Измерения проводили в трехкратной повторности (n = 3). Статистическую обработку результатов выполняли в программе PSPP (Free Software Foundation Inc., США).

Результаты и их обсуждение

Сравнение оригинального и модифицированного методов Фолина-Чокальтеу. Напитки Nemoloko овсяные различной жирности были проанализированы с использованием оригинального и модифицированного методов Фолина-Чокальтеу (табл. 1). Применение модифицированного метода привело к получению значимо больших величин АОЕ (p < 0,01), что в процентном отношении характеризовалось приращением величины АОЕ на (37 ± 12) %. Полученные результаты объясняются вкладом жирорастворимых антиоксидантов в измеряемую величину АОЕ. Разработчики модифицированного метода продемонстрировали это на примере анализа природных (α-токоферол, β-каротин) и синтетических (Е312, Е319, Е320, Е321) жирорастворимых антиоксидантов [15]. Между полученными результатами наблюдалась линейная положительная     корреляция     (r = 0,92, p = 0,076), что свидетельствует о весьма высокой связи между сравниваемыми методами. Далее в анализе напитков использовали модифицированный метод Фолина-Чокальтеу.

Оценка АОЕ кофе при добавлении эмульсионных растительных напитков. В литературе сообщалось об отрицательном, нейтральном и положительном влиянии коровьего молока на АОЕ кофе, что привело к дискуссии в научном сообществе. Противоречивые результаты были связаны с влиянием различных факторов, включая тип кофе, тип и количество добавленного молока, способ приготовления напитка, используемый метод анализа [16]. С помощью оригинального метода Фолина-Чокальтеу было показано, что добавление молока в кофе сопровождается увеличением АОЕ полученных напитков, при чем увеличение АОЕ пропорционально жирности используемого молока [17]. Полученные результаты объясняются корреляцией между содержанием антиоксидантов и концентрацией липидов в молоке [18,19].

В этой работе мы проанализировали АОЕ напитков, полученных смешением кофе с эмульсионными растительными напитками или молоком в соотношении 4:1 по объему. Жирность молока (1 %) соответствовала жирности эмульсионных растительных напитков (1,0–1,1 %). Полученные результаты представлены в табл. 2. Молоко, напитки овсяный, миндальный и соевый не оказывали значительного влияния на АОЕ кофе. Добавление рисового напитка в кофе привело к уменьшению АОЕ последнего с 2246 до 1997 мг-экв ГК/л ( p < 0,05), что в процентном отношении характеризовалось снижением величины АОЕ на 11 %.

Анализ витаминов . Некоторые эмульсионные растительные напитки, проанализированные в этом исследовании, содержали в составе витамины B 2 , B 12 и D. О том, что витамин B 2 (рибофлавин) не окисляется реагентом Фили-на-Чокальтеу, сообщалось ранее [13]. В этой работе водорастворимый витамин B₁₂ (циано-

Таблица 1

АОЕ напитков овсяных (n = 3)

Жирность, %	АОЕ, мг-экв ГК/л		Отклонение, %	p -значение
	Оригинальный метод	Модифицированный метод
0,5	384 ± 18	597 ± 42	+35,7	0,004
1,5	831 ± 35	1441 ± 87	+42,3	0,003
3,2	589 ± 31	1147 ± 82	+48,6	0,003
12,0	1369 ± 65	1719 ± 105	+20,4	0,005

Таблица 2

АОЕ кофе с добавлением полуобезжиренного молока и напитков растительных (n = 3)

Образец АОЕ, мг-экв ГК/л Отклонение, % p-значение Кофе 2246 ± 55 — — Кофе + 20 % молока 2269 ± 101 +1,0 0,731 Кофе + 20 % напитка овсяного 2197 ± 90 –2,2 0,445 Кофе + 20 % напитка рисового 1997 ± 84 –11,1 0,036 Кофе + 20 % напитка соевого 2058 ± 89 –8,4 0,067 Кофе + 20 % напитка миндального 2147 ± 97 –4,4 0,219 кобаламин) и жирорастворимый витамин D3 (холекальциферол) были проанализированы с помощью модифицированного метода Фолина-Чокальтеу на предмет возможной интерференции. Цианокобаламин в концентрации 500 мг/л не давал аналитического сигнала. Растворенный в подсолнечном масле холекальциферол (40 мг/л) и чистое рафинированное подсолнечное масло давали приблизительно одинаковый аналитический сигнал. Таким образом, содержащиеся в эмульсионных растительных напитках витамины не оказывали влияние на измеряемую величину АОЕ.

Заключение

Многочисленные исследования продемонстрировали связь между употреблением в пищу растительных полифенолов и здоровьем человека, однако надежные методы определения общего содержания полифенолов до сих пор отсутствуют. В этой работе мы применили модифицированный метод Фолина-Чокальтеу в оценке антиоксидантной емкости (АОЕ) эмульсионных растительных напитков, в том числе в смеси с кофе. Высокая положительная корреляция модифицированного и оригинального методов Фолина-Чокальтеу была показана в анализе овсяных напитков различной жирности. Добавление 20 % овсяного, миндального и соевого напитков не влияло на АОЕ кофе, тогда как добавление аналогичного количества рисового напитка снижало АОЕ кофе на 11 %. Это исследование продемонстрировало, что эмульсионные растительные напитки не оказывают существенного влияния на антиоксидантные свойства кофе. Однако необходимы дополнительные исследования с привлечением антиоксидантных методов на основе переноса атома водорода и хелатирования металла.