Проблема отторжения сердечного трансплантата и пути оптимизации оценки результатов эндомиокардиальной биопсии

Одной из ведущих причин смерти в течение первых трех лет после трансплантации является отторжение сердечного трансплантата [1, 2]. Острое клеточное отторжение в течение первого года жизни реципиентов встречается в 2040% случаев, гуморальное – в 10% случаев [1, 2]. Острое клеточное отторжение развивается, как правило, в период от 1 недели до 6 месяцев, острое гуморальное-от нескольких дней до 4-х недель после трансплантации сердца в организме сенсибилизированного реципиента [1, 2].

Хроническое отторжение наблюдается от 6 месяцев и более. Большинство пациентов при отторжении не имеет клинических проявлений, что требует регулярного проведения эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ) [1, 2] .

Проведение ЭМБ с последующей гистологической и иммуногистохимической оценкой материала считается основным стандартизированным методом выявления и оценки степени тяжести отторжения [1, 2]. Несмотря на то, что ЭМБ представляет собой единственный стандартизированный метод диагностики отторже- ния, в ряде случаев она может привести к противоречивой субъективной оценке степени отторжения и интерпретации образцов биопсии между патологами [1, 2].

Материалы и методы

В ГБУЗ «НИИ-ККБ №1 им. проф. С.В. Очаповского» проводилась научноисследовательская работа, целью которой был иммуногистохимический подсчет одноядерных воспалительных клеток в 309 биоптатах с последующим сопоставлением с каждой степенью отторжения. Все биоптаты были разделены на 4 группы: группа № 1 (n = 150) – образцы, в которых не наблюдалось признаков клеточного и гуморального отторжения (ACR 0, AMR 0); группа № 2 (n = 90) – биоптаты с клеточным отторжением 1 степени (ACR 1); группа № 3 (n = 45) – образцы, соответствующие клеточному отторжению 2 степени (ACR2), группа № 4 (n = 24) – биоптаты с гуморальным отторжением (AMR 1).

С помощью компьютерного морфометрического анализа оценивали площадь биопта-та, площадь инфильтрата, затем процентное содержание СD3+ (Т-лимфоцитов), CD20+ (В-лимфоцитов), CD68+ (макрофагов), С4d (компонента комплемента), С3d (компонента комплемента).

Результаты и их обсуждение

Существует ряд проблем при интерпретации результатов эндомиокардиальной биопсии. Так, с гистологической точки зрения, результаты биопсии, расцениваемые в соответствии с классификацией клеточного отторжения как ACR 0 (без признаков клеточного отторжения) могут быть противоречивыми, так как те же данные, полученные из более глубокого слоя миокарда, будут расценены как ACR 1 (клеточное отторжение 1 степени) или даже ACR 2 (клеточное отторжение 2 степени), в зависимости от количества и площади охвата инфильтрата и миоцитарных повреждений. В другом случае – небольшая область с менее компактнораспространенным клеточным инфильтратом между миоцитами может быть определена как диффузный процесс одними патологами, а другими – как фокусный очаг, если основываться на утверждениях, что эта область представляет собой только малую часть одного из четырех фрагментов биопсии. Более того, присутствие внутритканевого инфильтрата с сопровождающимся фиброзом или старым миоцитарным повреждением может быть достоверно сложно или не- возможно классифицировать – это могут быть последствия предыдущей биопсии, либо предыдущие ишемические повреждения с реактивным воспаленным инфильтратом, или частично вылеченный очаг клеточного отторжения с соответствующей структурой [4].

Проведение процедуры биопсии может быть сопряжено с артефактами, что также отразится на постановке диагноза в преувеличении или недооценке степени отторжения. Первая категория артефактов может быть связана с техникой биопсии. Вторая категория артефактов относится к предтрансплантационному периоду, что является следствием периода ишемии между извлечением сердца из организма донора и трансплантацией реципиенту. Третья категория артефактов является следствием предыдущих биопсий [5]. Причина сложности диагностики гуморального отторжения заключается в том, что гистологические признаки этого серьезного осложнения обычно очень «неуловимы» или даже почти полностью отсутствуют [6].

В 10-20% случаев биопсия показывает воспалительные инфильтраты из мононуклеаров в эндокарде. Многие патоморфологи расценивают проявление эффекта Quilty с развитием клеточного отторжения [7].

Все изложенное требует поиска объективной оценки результатов ЭМБ.

Результаты проведенного нами количественного анализа показали, что с увеличением степени клеточного отторжения отмечается нарастание степени выраженности клеточного инфильтрата, т.е. возрастает процентное содержание Т- и В- лимфоцитов, макрофагов, компонентов комплемента С3d и С4d. В воспалительных инфильтратах при клеточном отторжении преобладают преимущественно CD3+ (Т-лимфоциты) и CD68+ (макрофаги), в меньшей степени -CD20+ (В-лимфоциты). При гуморальном отторжении также преобладают в клеточном инфильтрате преимущественно CD3+ (Т-лимфоциты) и CD68+ (макрофаги). Процент содержания клеток в воспалительном инфильтрате при гуморальном отторжении выше, чем при клеточном отторжении.

Результаты дискриминантного анализа показали, что наилучшая разделительная способность при отторжении с целью дифференцировки групп принадлежит CD3+ (Т-лимфоцитам) и CD68+ (макрофагам). Чем ближе значения показателей CD3+ (Т-лимфоцитов) и CD68+(макрофагов) исследуемого реципиента к одному из пороговых уровней, тем с большей вероятностью этого реципиента можно отнести к соответствующей группе отторжения. Для группы ACR0 пороговые значения составили: CD3+ (Т-лимфоцитов)-(0,98 %), CD68+ (макрофагов) - (0,34 %); для группы ACR1: CD3+(t-лимфоциты) -(2,03 %), CD68+ (макрофаги) -0,90 %; для группы ACR2: CD3+(Т-лимфоциты) -(3,4 %), CD68+(макрофаги)-(1,35 %); для группы AMR1: CD3-(4,75 %), CD68 (1,4 %). Иммуногистохимический подсчет клеток CD68+ (макрофаги) и CD3+ (Т-лимфоциты) показал высокую чувствительность (91%) и специфичность (91%) в прогнозировании степени отторжения. ROC-анализ CD3+ (Т-лимфоцитов) в диагностике отторжения показал: вероятность болезни при положительном диагнозе – 90,5%, вероятность болезни при отрицательном диагнозе – 8%, AUC 90% (отличный классификатор), относительные риски 11,3 (рис. 1). ROC -анализ CD68 + (макрофагов) в диагностике отторжения показал: вероятность болезни при положительном диагнозе – 90,5%, вероятность болезни при отрицательном диагнозе – 8%, AUC 90 % (отличный классификатор), относительные риски 11,3 (рис. 2).

Мы представлям применение расчетных показателей в клинической практике.

Пациент, П., 19 лет. С 2012 г. установлен диагноз дилатационной кардиомиопатии, в апреле того же года в связи с ХСН IV ФК по NYHA выполнена операция трансплантации сердца. Ранний послеоперационный период протекал без осложнений. На протяжении последующих 5 лет реципиент планово госпитализировался в кардиологическое отделение в соответствии с графиком выполнения ЭМБ и коронароангиогра-фии. В течение этого периода эпизоды отторжения не наблюдались, состояние коронарного русла удовлетворительное; результаты эхокардиографии (ЭХО-кг) с оценкой глобальной сократимости, параметры импульсно-волновой (PW) и тканевой допплерографии (PW-TDI) значимо не выходили за рамки нормативных значений. После оперативного вмешательства до настоящего времени реципиент находился на базовой иммуносупрессивной трехкомпонентной терапии: глюкокортикотикостероиды, ингибиторы кальциневрина, цитостатитки. Дополнительно принимал липидснижающие препараты, ингибиторы протонной помпы. К апрелю 2017 г. объективный статус пациента соответствовал I ФК по NYHA. В июне 2017 г. стал отмечать ухудше- ние, присоединились жалобы на одышку, снижение толерантности к физической нагрузке, в связи с чем обратился к кардиологу поликлиники ГБУЗ «НИИ-ККБ №1 им. С.В. Очаповско-го». На амбулаторном приеме выполнены: ЭКГ, ЭХО-кг, ОАК, биохимия крови, оценка уровня такролимуса. Результаты ЭХО-кг в сравнении с предыдущими выявили снижение фракции выброса (ФВ) с 60% до 40%, нарастание недостаточности митрального клапана, присоединение легочной гипертензии, выпот в полости перикарда, плевральных синусах, умеренную дилатацию предсердий и правого желудочка. Отрицательная динамика по данным ЭХО-кг, ухудшение состояния указывали на отторжение трансплантата, что потребовало экстренной госпитализации для выполнения ЭМБ и уточнения диагноза. На госпитальном этапе выполнялся спектр основных и дополнительных диагностических исследований в соответствии с рекомендациями ISHLT при подозрении на клеточное и гуморальное отторжение: ЭМБ с исследованием срезов с помощью световой микроскопии и иммуногистохимического исследования, оценка антител к комплексу HLA, ОАК, ОАМ, биохимии крови, контроль ЭХО-кг [3]. Результаты ЭМБ с помощью световой микроскопии выявили острое клеточное отторжение ACR 1 степени и отсутствие признаков гуморального отторжения в соответствии с критериями ISHLT диагноза клеточного отторжения от 2004 г. и гуморального отторжения от 2004 г., пересмотра критериев от 2013 г. Выполнялась дополнительно методика speckle-tracking echocardiography при подозрении на криз отторжения с целью получения более полной информации о миокардиальной функции желудочков. В дальнейшем био-птат подвергся иммуногистохимическому исследованию – признаков гуморального отторжения выявлено не было. Не были выявлены также антитела I и II класса к комплексу HLA. Несмотря на отрицательные результаты от выполненных ранее диагностических процедур, мы провели количественную оценку клеточного инфильтрата биоптата от 12.07.2017 с помощью компьютерного морфометрического анализа. Количественный подсчет клеток выявил: СD 3+ (Т-лимфоциты) -3,1%, СD 20+( В-лимфоциты) -6,5 %, C3d -2,23%, C4d -2,17%, CD 68+(макро-фаги) -1,3%. Сопоставляя эти данные с результатами нашей научно-исследовательской работы, а также критериями диагноза отторжения ISHLT, количественные параметры соответ-

Таблица 1

Результаты динамического наблюдения параметров трансторакальной, импульсно-волновой и тканевой допплерографии у реципиента с подозрением на криз отторжения

Примечание: КДР ЛЖ – конечный диастолический размер левого желудочка, КДО ДЖ – конечный диастолический объем левого желудочка, КСО ЛЖ – конечный систолический объем левого желудочка, ФВ – фракция выброса, ПЖ – полость правого желудочка,СДЛА – систолическое давление в легочной артерии,Е – пик раннего диастолического наполнения,А – пик позднего диастолического наполнения,Е/А – соотношение пиков раннего и позднего наполнения,S – систолический пик левого и правого желудочков,Е/Еm – соотношение пиков раннего диастолического наполнения к раннедиастолическому смещению тканей митрального кольца, GLSLV – пиковый продольный систолический стрейн левого желудочка, RadSLV – радиарный систолический стрейн левого желудочка, CirSLV – циркулярный систолический стрейн левого желудочка, Rot base – ротация базальных сегментов,Rot apex – ротация верхушечных сегментов,Twist – скручивание левого желудочка.

ствуют гуморальному отторжению.

Несмотря на продолжающийся диагностический поиск, пульс-терапия глюкокортикостероидами 1000 мг внутривенно №3 была начата сразу же после получения результатов ЭМБ с помощью световой микроскопии с последующим переводом на пероральный прием и постепенным снижением дозы. В течение 6 дней на фоне проводимой терапии отмечалась положительная клиническая динамика, а также увеличение ФВ с 40% до 45-46%, по данным speckletracking echocardiography – улучшение функции циркулярных, радиарных волокон, механики сердца, но сохранялась сниженной продольная функция миокарда (таблица 1). К 9 дню терапии ФВ увеличилась до 50-52%, но сохранялась сниженной функция продольных волокон, функция циркулярных, радиарных волокон и механика сердца были восстановлены (таблица 1). На 21-й день терапии ФВ увеличилась до 5253%, повысилась толерантность к физической нагрузке, но сохранялась сниженной функция продольных волокон, недостаточность митрального клапана, умеренная легочная гипертензия. Продолжен пероральный прием глюкокортикостероидов (метипред 4 мг 7 таблеток) с последующим уменьшением дозы, ингибиторы кальци-неврина (такролимус 1,5 мг х 2 раза в день), цитостатики (микофеноловая кислота, микофенолат мофетил 1000 мг х 2 раза вдень). Решение об уменьшении дозы глюкокортикостероидов принимается в соответствии с результатами ЭХО-кг и методики speckle-trаcking echocardiography. ЭМБ планируется в динамике через 3 недели.

Анализ клинического наблюдения

Как известно из источников мировой литературы, между морфологическими изменениями при остром, клеточном и гуморальном отторжении и параметрами ЭХО-кг, методики speckle-tracking echocardiography существует взаимосвязь [8-10]. Изменения, выявленные при ЭХО-кг у реципиента, указывали на криз гуморального отторжения: снижение ФВ левого желудочка, дилатация и снижение фрак- ции правого желудочка, недостаточность митрального клапана; умеренная легочная гипертензия. Результаты методики speckle-tracking echocardiography выявили выраженное нарушение функции продольных волокон, а также циркулярных, радиарных волокон левого желудочка, продольных волокон правого желудочка, механики сердца. Такие изменения миокардиальной функции также больше указывают на гуморальное отторжение.

Наличие клинических проявлений у нашего реципиента, результаты ЭХО-кг, speckletracking echocardiography не исключали либо острого клеточного отторжения более высоких градаций, более 1 степени, либо наличие смешанного отторжения или присутствие гуморального отторжения AMR 1-2 степени, что поспособствовало продолжению диагностического поиска. Компьютерный морфометрический анализ выявил признаки гуморального отторжения.