Прогнозирование появления высокотрансмиссивных штаммов вируса Sars-Cov-2 на территории Санкт-Петербурга с использованием рекуррентной нейронной сети

Введение. Первые случаи нового заболевания, приводящего к развитию тяжёлого острого респираторного синдрома, были зарегистрированы в конце 2019 года в китайском городе Ухань. Вскоре стало известно, что болезнь вызвана новым одноцепочечным РНК(+)-вирусом SARS-CoV-2, относящимся к семейству β-коронавирусов. В настоящее время болезнь, получившая название COVID-19 (аббревиатура от англ. COronaVIrus Disease 2019 — коронавирусная инфекция 2019 года), распространилась по всему миру и приняла характер пандемии [1,2].

Проникновение вирусных частиц внутрь клетки-хозяина происходит за счет связывания гликозилированных S-белков, которые находятся на поверхности вируса, с рецептором ангио-тензинпревращающего фермента 2 (АПФ2). Внутри клетки происходит репликация вирусной РНК, синтез структурных белков и сборка вирусных частиц, после чего упакованные вирусные частицы высвобождаются через лизосомы [3,4].

Вирус SARS-CoV-2 вызывает развитие респираторной инфекции, оказывающей также значительное влияние на систему кроветворения и гемостаз. Среди наиболее распространенных гематологических изменений отмечают лимфопению, нейтрофилию, эозинопению, тромбоцитопению и тромбоцитоз [5]. Кроме того, у пациентов с тяжелым течением заболевания отмечалось аномальное присутствие предшественников эритроцитов в периферической крови [6,7].

Значительным открытием стало обнаружение рецептора АПФ2 на поверхности гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников [8,9]. Важной особенностью является тот факт, что клетки-предшественники эритроцитов - ERP-S2 (CD71+ CD235A-) и ERP-S3 (CD71+ CD235a+) способны инфицироваться SARS-CoV-2, который успешно амплифици-ровал свой геном внутри этих клеток [9]. Именно связывание S-белка с рецептором АПФ2 является ключевым этапом инфицирования. При изучении этого процесса было показано, что S-белок, находящийся на поверхности вириона в тримерном состоянии, связывается с АПФ2 и расщепляется на субъединицы S1 и S2 [10–12]. Субъединица S1 содержит домен связыва- ния рецептора (RBD, 319-541 а.к.), который непосредственно связывается с доменом пептидазы (PD) рецептора АПФ2, в то время как S2 отвечает за слияние мембран. В структуре RBD особо выделяют рецептор-связывающий мотив RBM (437-508 а.к.) – участок, содержащий большинство контактирующих аминокислотных остатков S-белка, которые связываются с АПФ2 рецептором. В составе S1 субъединицы важным является также N-терминальный домен (NTD), который хоть и является менее иммуногенным, чем RBD, однако, недавние исследования показали способность анти-NTD антител нейтрализовать SARS-CoV-2 [12,13].

Важно отметить, что RBD является наиболее изменчивым у родов Coronavirinae и рассматривается как ответственный за вирусную трансмиссивность и адаптацию [1,14]. Шесть аминокислот SARS-CoV-2 являются критическими для связывания с АПФ2 рецептором и определения видоспецифичности – L455, F486, Q493, S494, N501 и Y505. Интересным является тот факт, что 5 из шести данных аминокислот не соответствуют вирусу SARS-CoV, который также проникает в клетки за счет связывания с АПФ2 рецептором [15]. Кроме того, для SARS-CoV-2 были получены доказательства существования положительного отбора, направленного на закрепление определенных мутаций в S-гене [16]. Поэтому, совершенно неудивительно, что внимание многих ученых направлено на изучение механизмов формирования комплекса S-белок - АПФ2, отслеживание мутаций, появляющихся в S гене, создание лекарств и вакцин, блокирующих именно S-белок SARS-CoV-2 [17–19].

В решении таких задач большую роль играют методы математической биологии. Так, компьютерное моделирование белков нашло широкое применение при анализе формирования комплекса S-белок – АПФ2-рецептор [10,20–23]. Моделирование позволяет оценить влияние мутаций в S-белке на связывание с АПФ2 рецептором, что определяет патогенность и вирулентность новых штаммов [24]. Неслучайно, наиболее быстрое распространение в популяции имеют штаммы, мутации в которых повышают связывающую способность S-белка с АПФ2 рецептором [25,26].

Эпидемиологические и биохимические исследования показывают, что трансмиссивность различных штаммов SARS-CoV-2 пропорциональна аффинности связывания [11,27]. Следовательно, трансмиссовность SARS-CoV-2 может быть теоретически оценена по аффинности связывания RBM-АПФ2. Соответственно, следует отслеживать появление мутаций, повышающих аффинность данного комплекса, поскольку именно таким мутациям благоприятствует естественный отбор [28].

Алгоритмы машинного обучения активно используются в вычислительной биологии и биоинформатике для прогнозирования мутаций. Например, нейронные сети успешно применяются для прогнозирования мутаций в вирусах гриппа [29], точечных мутаций, возникающих при выравнивании последовательностей РНК [30] и мутаций в определенных сайтах [31]. Несмотря на разнообразие алгоритмов, возникает проблема с динамическим моделированием последовательных данных. Так, появление рекуррентных нейронных сетей (RNN) c долговременной и кратковременной памятью (LSTM) нашло применение для решения проблемы управления нелинейной динамикой в исследованиях временных рядов [32]. Было показано, что модели, основанные на RNN превосходят модели на основе логистической регрессии (LR) и методе опорных векторов (SVM) [33]. Это связано с тем, что модели на основе RNN в отличие от LR и SVM могут использовать свою внутреннюю память для обработки последовательностей произвольной длины. Модель на основе RNN-LSTM использовалась для предсказания возникновения мутаций в геномной последовательности SARS-CoV-2 и показала увеличение количества замен C>T в будущем времени [34], а также легла в основу конвейера «Tempel», предсказывающего вероятность появления мутаций вируса гриппа в следующем сезоне, опираясь на временные данные о последовательностях гемагглютинина [33].

Помимо выбора модели и обучающего алгоритма необхо- димо правильно представить входные данные. Применение нейронных сетей к численно преобразованным последовательностям аминокислот или нуклеиновых кислот демонстрирует неоднозначные результаты [30]. Поэтому одним из решений проблемы подготовки входных данных является применение методов обработки естественного языка (NLP) [33,35,36]. NLP позволяет представить аминокислотную последовательность в виде многомерных векторов. В частности, ProtVec преобразует аминокислотную последовательность в виде перекрывающихся «биологических» слов, состоящих из 3 аминокислот, представленных в векторе 1*100 [32]. Предсказание возникновения новых штаммов с новыми свойствами, в частности, повышенной трансмиссивностью за счет более эффективного связывания вирусных частиц с рецепторами на поверхности клеток, позволяет заранее решить ряд эпидемиологических задач в период пандемии – оценить эффективность уже существующих вакцин против возможных штаммов, дает время на создание новых вакцин и на подготовку системы здравоохранения к новым «волнам» эпидемии. Разработка механизмов оценки появления новых трансмиссивных штаммов найдет свое значение и в фундаментальной науке, позволив, например, объяснить влияние SARS-CoV-2 на гематологический статус пациента. Именно поэтому целью нашей работы стало предсказание возникновения мутантных штаммов с повышенной трансмиссивностью SARS-CoV-2 на территории Санкт-Петербурга. Для этого нами была изучена вариабельность S-белка у штаммов SARS-CoV-2, выделенных на территории Санкт-Петербурга с 15 марта 2020 года по 16 июня 2021 года. На основе проанализированных последовательностей методами машинного обучения нами было предсказано появление новых мутаций и проведена оценка их влияния на связывание S-белка с АПФ2 рецептором, т.е. транс-миссивность штаммов.

Материалы и методы. Для проведения анализа использовались данные, представленные на сайте GISAID (https://www. [37]. В анализ брали аминокислотные последовательности S-белка SARS-CoV-2, полученные из образцов клинического материала в период с середины марта 2020 года по середину июня 2021 года. По состоянию на 16 июня 2021 года в этой базе содержалось 852 полных последовательности S-белка SARS-CoV-2, полученных на территории Санкт-Петербурга. В качестве референсной последовательности использовали Wuhan-Hu-1 (EPI_ISL_402124) [38].

Филогенетический анализ проводили с использованием пакета BioPython [39] для Python и свободного программного обеспечения UGENE v.39.0 ru/) [40]. Множественное выравнивание последовательностей проводили c помощью алгоритма MUSCLE [41]. Для построения филогенетического дерева использовали метод максимального правдоподобия (ML).

Для предсказания мутаций использовали конвейер, основанный RNN, представленный в работах Rui Yin, а также Shashata Sawmya с соавторами [31,33].

Для предварительной подготовки входных данных следовали протоколу, представленному в работе Rui Yin [33]. Выровненные последовательности были разделены на три волны заболеваемости в соответствии с данными Роспотребнадзора. Первая волна – с марта 2020 по сентябрь 2020, вторая волна – с октября 2020 по март 2021 и третья волна – с апреля 2021 по июнь 2021. Входные данные представлены в виде 1254*100-мерного векторного пространства на основе ProtVec [36]. Прогнозирование мутаций проводили на фрагменте RBM мотива (437-507 а.к.).

Для прогнозирования мутировавшей аминокислоты в предсказанной позиции использовали таблицу вероятности мутаций аминокислот, представленную в работе Shaomin Yan и Guang Wu [42].

Для моделирования по гомологии фрагмента S-белка SARS-CoV-2 (331-524 а.к.), содержащей предсказанные мутации в RBM мотиве, использовали сервер SWISS-MODEL (https://swissmodel. [43–47]. В качестве шаблона использовали структуру S-белка SARS-CoV-2 (7ddn) из базы данных PDB (http://www.

Рис. 1. Филогенетическое дерево вариантов S-белка, распространенных на территории Санкт-Петербурга. Стрелкой отмечена референсная последовательность S-белка Wuhan-Hu-1 (EPI_ISL_402124).

Рис. 2. Точность прогноза мутаций аминокислотных остатков. Черная линия обозначает базовую линию.

Рис. 3. Прогноз потенциальных мутаций аминокислот по позициям L455,

R457, N481, T500, G504 на основе вероятности трансляции между кодо-

нами РНК и мутированными аминокислотами. Аланин; R, Аргинин; N, Аспарагин; D, Аспарагиновая кислота; V, Валин; H, Гистидин; G, Глицин; Q, Глутамин; E, Глутаминовая кислота; I, Изолейцин; L, Лейцин; K, Лизин; M, Метионин; P, Пролин; S, Серин; Y, Тирозин; T, Треонин; W, Триптофан; F, Фенилаланин; C, Цистеин; STOP, стоп-кодон

Для моделирования взаимодействия между фрагментами, содержащими предсказанные мутации в RBM мотиве S-белка (331-524 а.к.) и АПФ2 рецептором (6M17) использовался сервер ClusPro [49–52]. Скоринг функция для отбора наиболее правдоподобных моделей:

E=0,4E_rep+(-0,4E_att )+600E_elec+1,00E_DARS, где E_rep и E_att- вклады в межмолекулярные силы Ван-дер-ваальса, E_elec-электростатическая энергия, E_DARS-потенциал, основанный на парной структуре [49–52].

Для прогнозирования аффинности в белок-белковых комплексах использовали сервер PRODIGY [53,54]. Полученные данные визуализировали с помощью программы PyMol [55].

Результаты. Анализ множественного выравнивания последовательностей, показал, что NTD область (139-168 а.к.) и RBD домен (319-541 а.к.) являются наиболее вариабельными. Филогенетический анализ вариантов S-белка показал, что на территории Санкт-Петербурга преобладают линии AT.1, B.1.1.523, B.1.1.7, B.1.617.2,3, B.1.1.317 (Рисунок 1). Далее работу вели только с фрагментом RBD домена (331–524 а.к.), поскольку именно он является ключевым в связывании S-белка с АПФ2 рецептором [12,13].

Конвейер, основанный на рекуррентной нейронной сети, предсказал 5 ключевых аминокислот, в которых может произойти мутация в ходе эволюции. Лейцин (L) в 455 положении, аргинин (R) в 457, аспарагин (N) в 481, треонин (T) в 500 и глицин (G) в 504. Результат точности (Accuracy) прогнозирования мутаций аминокислотных остатков представлен на рисунке 2. На рисунке 3 показана вероятность мутации аминокислот в предсказанных положениях в другую аминокислоту.

Для дальнейшего анализа были выбраны преобладающие замены: L455F, L455V, R457G, R457S, N481K, T500S, G504R.

С помощью сервера SWISS-MODEL были получены третичные структуры фрагментов (331–524 а.к.) S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 и SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 с внесенной мутацией в 455 положении, а также, референсного S-белка SARS-CoV-2 с мутациями в положении 455, 457, 481, 500, 504. С помощью сервера ClusPro было проведено молекулярное моделирование взаимодействия полученных фрагментов с АПФ2 рецептором. Визуализация моделей взаимодействия фрагментов S-белка линии B.1.617.2 и референсного S-белка SARS-CoV-2 с мутацией в ключевой аминокислоте L455 с АПФ2 рецептором представлена на рисунке 4.

Для всех построенных моделей была проведена оценка энергии и аффинности связывания. Средняя и низшая энергия связывания фрагментов (331–524 а.к.) S-белка SARS-CoV-2 с АПФ2 рецептором, полученная с помощью сервера ClusPro, представлена на рисунке 5А. Предсказание аффинности связывания моделей белок-белкового комплекса представлено на рисунке 5Б.

Обсуждение. Анализ геномных изменений вирусов, в частности SARS-CoV-2, является одним из ключевых этапов реагирования и борьбы с распространением заболеваний. Секвенирование решает широкий спектр задач, направленных на идентификацию и характеризацию вируса (в частности, разработку диагностических тест-систем), изучение передачи и географического распространения и оценку эволюции вируса (WHO). Совместно с методами компьютерного моделирования секвенирование позволяет оценить влияние мутаций на трансмиссивность. Подключение к таким исследованиям машинного обучения даёт возможность предсказать появление новых опасных мутаций, что позволяет заранее принимать меры для предотвращения распространения новых штаммов и дает время на разработку новых лекарств и вакцин, что особенно актуально для пациентов с злокачественными опухолями системы крови, характеризующихся иммунодефицитом и находящихся на иммуносупрессивной терапии.

В нашей работе мы провели филогенетический анализ аминокислотных последовательностей штаммов, выделенных в Петербурге с марта 2020 по июнь 2021 гг., и оценили их генетическое разнообразие, обращая особое внимание на линии, которые имеют мутации в S-гене. Штаммы с мутациями в S гене, которые приводят к замене аминокислот в RBD домене и усиливают связывание с АПФ2, привлекают особое внимание из-за высокой скорости распространения, такие штаммы ВОЗ обозначает как «вызывающие опасения».

Так, среди линий, выявленных в Санкт-Петербурге с марта 2020 по июнь 2021, долю в 14,41% занимает линия B.1.1.317, имеющая мутации в S-белке Q675R, D138Y, S477N, A845S (Рисунок 1). Данная линия была впервые выявлена в марте 2020 во Вьетнаме и характеризуется, кроме того, мутацией в нуклеокап-сиде A211V. Варианты с такой мутацией мало распространились в мире, однако в России в феврале – марте 2020 года занимали 26,9% [56]. Данный набор мутаций обеспечивает штамму эффективное связывание с АПФ2 рецептором и ускользание от иммунного ответа [56].

Линия B.1.1.523, имеющая долю в 4,28% в Санкт-Петербурге (Рисунок 1), несет в себе мутацию E484K, характерную и для других штаммов, например, B.1.351 (Южная Африка) и B.1.1.28 (Бразилия) и вызывает особый интерес, поскольку способна снижать нейтрализацию антителами [57]. Штаммы с мутацией E484K, которая влияет на формирование комплекса с АПФ2, быстро вытеснили другие варианты вируса и распространились на другие страны [58]. Варианты SARS-CoV-2. Новости о вспышках болезней 31 декабря 2020 г. – ВОЗ; Nelson et al., 2021) [59].

Важно отметить значительную долю (5,64%) линии АТ-1 (B.1.1.370.1) [60] в анализируемых нами последовательностях (Рисунок 1). Данная линия впервые была выявлена в Северо-Западном федеральном округе и характеризуется вставкой N679delinsKGIAL и делецией по позициям C136_Y144del, находящимися в S-белке. Данные мутации могут оказывать влияние на эффективность разрезания S-белка фурином и на эффективность проникновения вируса в клетку [61]. Данный штамм распространился не только на Северо-Западе России, но и в таких странах как Финляндия, Германия, Британия .

На июнь 2021 года 22,87% секвенированных штаммов относятся к линии B.1.617 (Рисунок 1). Филогенетический анализ показывает наличие в Санкт-Петербурге линий B.1.617.2 и B.1.617.3. Данные линии были выделены в октябре-феврале 2020-2021 гг в Индии и несут важные замены в RBD домене – L452R и T478K. Линия B.1.617.2 характеризуется большей трансмиссивностью, а антитела и сыворотки вакцинированных людей хоть и способны нейтрализовывать данный штамм, но с гораздо более низкой эффективностью [62–64]. Большая доля данных штаммов от всех секвенированных образцов связана, как с доминированием данного штамма в мире на июнь 2021, так и с увеличением количества секвенируемых образцов в Санкт-Петербурге.

При сравнении филогенетических данных штаммов из Санкт-Петербурга с данными, полученными в других регионах, выявляется ряд общих черт распространения SARS-Cov-2 в России. Так, ни в одном регионе не был выявлен исходный штамм Wuhan-Hu-1, подавляющее большинство штаммов, циркулировавших на ранних этапах пандемии, относились к линиям B.1, B.1.1 и B.1.* (кладам G, GR, и GH), также обнаруживаются штаммы с мутациями, с которым ряд исследователей связывают уклонение от иммунного ответа (Водопьянов и др., 2020, Осина и др., 2020) [65]. Особенность филогении SARS-CoV-2 в Санкт-Петербурге является появление штамма AT-1, получившего название «северо-западный» [61].

Аминокислотные последовательности S-белка штаммов, получивших распространение на территории Санкт-Петербурга, использовались как входные данные для нейронной сети. В нашей работе мы показали возможное появление мутаций в позициях – L455, R457, N481, T500 и G504. В дальнейший анализ брали варианты S-белка с аминокислотными заменами, имеющими наибольшую вероятность (Рисунок 3) – L455F, L455V, R457S, R457G, N481K, T500S, G504R.

На основе предсказанных мутаций были построены модели взаимодействия фрагментов S-белка (331-524 а.к.) с измененными аминокислотами с АПФ2 (Рисунок 4). Оценку влияния

Рис 4. Визуализация моделей взаимодействия фрагмента S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 и референсного S-белка SARS-CoV-2 c АПФ2 рецептором. Черным прямоугольником выделена область, в которой происходит взаимодействие с АПФ2. Пунктирные линии – длина связи меньше 4 Å. А) Фрагмент референсного S-белка SARS-CoV-2. Б) Фрагмент референсного S-белка SARS-CoV-2 с мутацией в L455F. В) Фрагмент референсного S-белка SARS-CoV-2 с мутацией в L455V. Г) Фрагмент S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2. Д) Фрагмент S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 с мутацией в L455F. Е) Фрагмент S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 с мутацией в L455V.

Рис. 5. А) Средняя и низшая энергия связывания фрагментов (331–524 а.к.) S-белка SARS-CoV-2 с АПФ2 рецептором. Б) Предсказанная аффинность моделей белок-белкового комплекса. DELTA - Фрагмент S-белка SARS-CoV-2 линии B.1.617.2, REF - Фрагмент S-белка SARS-CoV2 Wuhan-Hu-1.

таких мутаций проводили в сравнении с соответствующим участком S-белка исходного штамма Wuhan-Hu-1. Мы показали, что данные мутации увеличивают аффинность связывания, что свидетельствует о формировании более стабильных комплексов (Рисунок 5Б).

Мутация в позиции L455 представляет особый интерес, поскольку данная аминокислота напрямую взаимодействует с АПФ2 рецептором в позициях D30, K31 и H34 [10,66]. Наши данные говорят о возможности возникновения замен L455V и L455F, причем мутация L455F предпочтительнее исходя из значений энергии связывания (-11,1 ккал/моль-1 и -12,1 ккал/ моль-1 соответственно) (Рисунок 5A). Штаммы с заменой L455F уже были идентифицированы в США [28]. Такая замена хоть и встречается с низкой частотой на территории США, однако, имеет наиболее высокие абсолютные изменения свободной энергии связывания из изученных авторами [28]. Примечательно предположение о том, что замена Tyr442→Leu455 повысила способность SARS-CoV-2-RBD связываться с рецептором АПФ2 по сравнению с SARS-CoV-RBD [22].

Исходя из ключевой роли данной аминокислоты в формировании комплекса S-белок – АПФ2 и полученных нами данных о более стабильных комплексах с мутациями L455V и L455F, был проведен анализ вариантов S-белка штамма B.1.617.2 (22,87% от всех проанализированных нами последовательностей) с АПФ2 рецептором (Рисунок 4Г-4Е). Аффинность комплекса S-белок (B.1.617.2) – АПФ2 составляет –11,4 ккал/моль-1, с мутацией L455F –11,8 ккал/моль-1, с мутацией - L455V –10,9 ккал/ моль-1 , что говорит о том, что данные мутации не оказывают существенного влияния на формирование комплекса (Рисунок 5). Однако данные, полученные нами на основе прогнозирования мутаций, а также тот факт, что мутация L455F уже выявлялась в популяции, говорят о том, что вероятность появления новых штаммов с такой мутацией достаточно высока. Так, на- пример, штаммы с мутацией D614G появились независимо в разных странах и закрепились в популяции, заменив исходный штамм Wuhan-Hu-1[67].Таким образом, проанализировав вариабельность S-белка у штаммов, выявленных на территории Санкт-Петербурга в период с 15 марта 2020 г. по 16 июня 2021 г., мы определили возможные сайты возникновения мутаций, предсказали преобладающие аминокислотные замены в данных сайтах и показали, что все предсказанные нами мутации оказывают влияние на связывание RBD домена S-белка с АПФ2 рецептором, увеличивая аффинность связывания. Это свидетельствует о формировании более стабильных комплексов S-белок/АПФ2-рецептор, а значит такие штаммы могут обладать большей трансмиссивностью. Полученные нами данные, а также опыт использования нейронных сетей для предсказания высококонтагиозных штаммов позволит в следующих работах оценить появление таких штаммов у когорты онкогематологи-ческих больных.

Конфликты интересов

Источник финансирования

Вклад авторов

Концепция и дизайн: Кустова Д.В., Кириенко А.Н.

Сбор и обработка данных: Кустова Д.В., Кириенко А.Н.

Представление материалов исследования: Кустова Д.В., Кириенко А.Н.

Анализ и интерпретация: Кустова Д.В., Кириенко А.Н.

Подготовка рукописи: Кустова Д.В., Кириенко А.Н., Мартын-кевич И.С.

Окончательное одобрение рукописи: Мартынкевич И.С.