Протеиназа бацилл на основе генной конструкции как кормовая добавка для птицеводства

Получение экономической выгоды от более полного усвоения зерновых кормов за счет повышения усвояемости питательных веществ оста-

^∗ Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и поддержана грантом РНФ ¹ 16-16-04062.

ется актуальной проблемой в птицеводстве (1-5). Задача может быть решена с помощью комплекса ферментов, включая бациллярные протеиназы. Протеиназы повышают переваримость белковых компонентов, необходимых для роста бройлеров, а также разрушают связи между белками, крахмалом или клетчаткой, что положительно влияет на усвояемость крахмала, повышая его биодоступность (6-10). Применение микробных протеаз также позволяет улучшить усвояемость кормов с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов (11-13). Введение в рацион кур-несушек мультиферментных комплексов (протеаза/ β -клюканаза/пектиназа) приводило к увеличению живой массы птицы, повышению массы яйца и образованию более темного желтка, а также положительно влияло на органы пищеварения (14). Кроме того, введение экзогенных протеиназ в корма повышает переваримость питательных веществ вследствие воздействия на антипитательные факторы рациона, например за счет деструкции ингибиторов трипсина и лектинов в соевом шроте (15, 16). Экзогенные протеазы служат профилактическим средством, снижая количество непереваренного белка, который служит фактором колонизации кишечника патогенными микроорганизмами, приводя к развитию кокцидиоза и некротического энтерита у цыплят (17, 18). Установлена роль непереваренного белка в развитии дисбактериоза, вызывающего некротический энтерит (19, 20). Добавление протеазы улучшало продуктивность бройлеров, инфицированных Eimeria spp. (каузативный агент некротического энтерита) (21) . Комплексные препараты живых бактерий или спор в комбинации с экзогенными протеазами оказывают на цыплят ростостимулирующее и профилактическое действие (22, 23)

Поиск новых продуцентов и получение эффективных рекомбинантных микробных ферментов, применяемых в качестве кормовых добавок, — важная биотехнологическая задача (24-26). Для получения кормовых добавок на основе микробных протеиназ в необходимом количестве разрабатывают эффективные экспрессионные системы (27). Недорогие компоненты сред для культивирования бацилл, а также безопасный статус этих микроорганизмов определяют перспективность их использования в птицеводстве.

В настоящем сообщении мы впервые представляем данные о получении высокоочищенной секретируемой субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus pumilus при экспрессии рекомбинантных векторов в штаммах B. subtilis и приводим основные физико-химические и биологические характеристики рекомбинантного продукта, определяющие перспективность его применения в качестве кормовой добавки.

Цель нашего исследования — получение с использованием экс-прессионной системы высокоочищенной субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus pumilus как кормовой добавки для птицеводства.

Методика . В работе использовали штаммы и плазмиды из музея лаборатории микробных биотехнологий Казанского федерального университета: природный изолят B. pumilus 7P, его стрептомицинустойчивый мутант B. pumilus 7Р/3-19, плазмиды pCS9 с геном субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus (предоставлена С.В. Костровым, Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва), pGP382 (предоставлена Dr Prof. Т. Mas-cher, Ludwig-Maximilians-Universit a t M u nchen, Германия). В качестве реципиента использовали протеазодефицитный штамм B. subtilis BG 2036 (любезно предоставлен Prof. E. Ferrarri, «Genencor Int., Inc.», США). Рекомбинантными векторами pTN 3036 (pLIKE-rep + aprBp ), pTN 3050 (pLIKE-rep + SP Pac + aprBp ), pTN 3093 (pLIKE-rep + SP Yngk + aprBp ) и pTN 3801 (pGP382 + aprBp ) трансформировали клетки протеазодефицитного штамма

B. subtilis BG 2036, в результате получили штаммы соответственно B. sub-tilis MRB044, B. subtilis MRB045, B. subtilis MRB046 и B. subtilis MRB072.

Штаммы выращивали в среде следующего состава (г/л): пептон бактериологический («Sigma», США) — 20, CaCl₂•2H₂O — 0,6, MgSO₄•7H₂O — 0,5, NaCl — 3, MnSO 4 — 0,1, Na 2 HPO 4 — 0,2, NH 4 Cl — 0,2. Штаммы B. sub-tilis , содержащие рекомбинантные конструкции, культивировали с добавлением эритромицина и линкомицина (соответственно 10 и 25 мкг/мкл), рекомбинантный штамм B. subtilis pCS9 — с добавлением эритромицина (20 мкг/мкл). Продуктивность синтеза субтилизиноподобной протеиназы оценивали отношением протеолитической активности к величине биомассы и выражали в условных единицах.

Активность протеиназы определяли по гидролизу азоказеина («Sigma», США) согласно описанию (28, 29). За единицу активности (EU) принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин. Специфичность протеиназы изучали по действию на p -цепь окисленного инсулина овцы (30). Измерения проводили на спектрофотометре xMark («Bio-Rad», США).

Для накопления протеиназы использовали биореактор (Biotron LiFlus SP30L («Biotron, Inc.», Корея). В реактор помещали 15 л среды, которую стерилизовали 30 мин при 121 ° С, рН среды доводился до рН 8,5 автоматически и поддерживался добавлением 2 н. NaOH через перистальтическую систему биореактора. В ферментер вносили 300 мл 16-часовой культуры (2 % от объема среды, OD 6 ₀₀ инокулята — 3 опт. ед.), антибиотик эритромицин (до конечной концентрации 10 мкг/мл) и пеногаситель Софэксил 1250 («Софэкс», г. Москва). Культивирование проводили в течении 24 ч при 37 ° С с постоянной аэрацией при скорости потока 10 л/мин (содержание О₂ не ниже 20 %) и постоянном перемешивании (150-900 об/мин). К 24 ч роста культуры, когда активность фермента достигала максимума (4,4 ед/мл, OD 6 ₀₀ — 6 опт. ед.) клетки удаляли центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин, Beckman Avanti JXN-26, «Beckman Coulter, Inc.», США). Очистку протеиназы проводили на колонке с карбоксиметилцел-люлозой (КМЦ) («Sigma», США). Супернатант, полученный после центрифугирования, разводили в 10 раз дистиллированной водой, доводили рН до 6,3 и смешивали с КМЦ, уравновешенной 0,02 М Na-ацетатным буфером (рН 6,3). Смесь выдерживали в течение 90 мин при постоянном перемешивании для сорбции фермента. Затем КМЦ осаждали, удаляли надосадочную жидкость и помещали сорбент на колонку. Колонку промывали тем же буфером, элюировали белок 0,2 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3 и измеряли активность фермента в полученных фракциях.

Молекулярную массу продуцируемой протеиназы определяли с помощью SDS-электорофореза (31) .

Физико-химические свойства полученного препарата протеиназы оценивали по температурному оптимуму в присутствии и в отсутствие ионов кальция (5 мМ СаCl₂). Для изучения термостабильности растворы ферментов в 0,05 М Tрис-HCl буфере (рН 7,2) инкубировали при температурах от 0 до 70 ° С в течение 30 мин, затем определяли активность при 37 ° С, как описано выше. Для оценки рН-оптимума определяли активность фермента в 0,05 М Tрис-HCl буфере. При изучении рН-стабильности инкубировали растворы белков в 0,05 М Tрис-HCl буфере в течение 1 ч при 25 ° С, далее добавляли раствор азоказеина и определяли активность при 37 ° С согласно приведенному выше описанию.

Влияние ингибиторов на протеиназу изучали с использованием фенилметилсульфонилфторида (PMSF), этилендиаминтетрауксусной кис-1276

лоты (EDTA), о-фенантролина (специфический ингибитор металлопротеиназ) и овомукоида (ингибитор трипсина). Раствор белка инкубировали с ингибитором в течение 1 ч при 37 ° С в Трис-HCl буфере (рН 7,2) и определяли протеолитическую активность, как описано выше.

Для имитации условий желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) кур использовали универсальный буфер Бриттона-Робинсона (32). Готовили серию из четырех аликвот универсального буфера (0,04 M) с разными значениями рН (2,9; 5,5; 6,0; 6,3 и 8,0). Фермент переносили из одного раствора в другой методом последовательных разведений и выдерживали в каждом из растворов соответствующее время; итоговое разведение фермента — в 200 раз. Последовательность аликвот соответствовала последовательности отделов ЖКТ кур: рН 5,5 (50 мин) — модель «зоб»; рН 2,9 (90 мин) — модель «желудок»; рН 6,5 (30 мин) — модель «тонкий кишечник», рН 8 (70 мин) — модель «толстый кишечник». На протяжении всего эксперимента температура буфера составляла 40 ° С.

Желчь, полученную от цыплят-бройлеров 10-суточного возраста, разводили 0,02 М Na-ацетатным буфером (рН 6,3). Пробы с содержанием желчи в ферментном растворе от 0,01 % до 5 % выдерживали при 40 ° С в течение 60 мин. Каждые 15 мин отбирали пробы для измерения активности. В качестве контроля использовали раствор фермента в 0,02 М Na-ацетатном буфере (рН 6,3) без желчи. Контрольный раствор фермента выдерживали при 40 ° С в течение 1 ч и определяли активность протеиназы.

Свойства протеиназы как кормовой добавки изучали в условиях крестьянско-фермерского хозяйства (дер. Среднее Азяково, Медведевский р-н, Республика Марий Эл). Для опыта отобрали 1-суточных цыплят кросса Cobb 500 (225 гол.) со средней живой массой 0,049±0,003 кг, из которых сформировали контрольную группу (75 гол.), получавшую в рационе стандартный комбикорм, и две опытные группы (по 75 гол.), где в комбикорм птице добавляли рекомбинантную протеиназу в дозе 5 EU/кг (I группа) или 15 EU/кг (II группа). Продолжительность опыта составила 42 сут. Цыплята в возрасте 0-10 сут получали комбикорм Старт, 11-20 сут — Рост, 21-42 сут — Финишер в соответствии с технологиями выращивания (ООО «Алгоритм инвестиций», г. Йошкар-Ола, Республика Марий Эл). Ферментный раствор вносили в сухой корм опрыскиванием пульверизатором при постоянном перемешивании. Цыплят содержали в вентилируемых клеточных батареях при температуре 35-36 ° С. Прирост массы у цыплят оценивали от начального до заключительного дня эксперимента ежедневно. Количество потребляемого корма пересчитывали на одного цыпленка. Коэффициент конверсии корма вычисляли, как отношение количества потребленного корма к приросту живой массы.

Токсичность препарата протеиназы исследовали на 1-суточных цыплятах кросса Cobb 500 массой 0,047±0,001 кг, из которых сформировали контрольную группу (15 гол.), получавшую только комбикорм, и опытную группу (15 гол.), где птице в комбикорм добавляли протеиназу (100 EU/кг корма) в течение 10 сут. В период опыта учитывали массу цыплят, наблюдали за их поведением, состоянием помета. Через 10 сут из каждой группы случайным образом отобрали по 3 цыпленка, которых усыпляли ингаляционным наркозом с помощью хлороформа для исследования состояния внутренних органов.

Статистическая обработка результатов включала расчет среднего значения ( M ) и стандартные ошибки среднего (±SEM). Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты. Мы сравнили экспрессию субтилизиноподобной внеклеточной сериновой протеиназы B. pumilus в природных и рекомбинантных штаммах. Штамм дикого типа B. pumilus 7P — природный изолят, который выделили по признаку повышенной продукции внеклеточной рибонуклеазы и других ферментов, включая протеиназу, B. pumilus 7P/3-19 — его стрептомицинустойчивый мутант. Мы получили рекомбинантный штамм B. subtilis pCS9, который несет мультикопийную плазмиду pCS9, содержащую ген протеиназы B. pumilus ( aprBp ) с собственным сигнальным пептидом под контролем собственного промотора. Для клонирования гена aprBp также использовали оптимизированную LIKE-систему экспрессии на основе промотора liaI B. subtilis , который регулируется двухкомпонентной индуцируемой антибиотиком системой LiaRS (33, 34). В составе вектора pLIKE-rep в штамм B. subtilis MRB044 ввели ген aprBp с собственным сигнальным пептидом (pTN 3036 — pLIKE-rep + aprBp ), в штамм B. subtilis MRB045 — с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида гена пенициллинамидазы (пенициллинамидогидролаза, КФ 3.5.1.11) B. megaterium (pTN 3050 — pLIKE-rep + SP_Pac + aprBp ), в штамм B. subtilis MRB046 — с последовательностью рекомбинантного сигнального пептида гена гликозидгидролазы (КФ 3.2.1.-) B. megaterium (pTN 3093 (pLIKE-rep + SP_Yngk + aprBp ). Для клонирования гена aprBp также использовали вектор экспрессии pGP382 с сильным конститутивным промотором (P _Deg Q ) (35). Ген degQ кодирует белок (46 а.о.), участвующий в фосфорилировании двухкомпонентной системы DegS/DegU, контролирующей синтез протеиназ (36). Штамм B. subtilis MRB072 содержал плазмиду pGP382 (pTN 3801 — pGP382 + aprBp ) с геном aprBp и Strep меткой в составе вектора для аффинной очистки белка. Сравнение экспрессии показало, что наиболее эффективным продуцентом протеиназы был штамм B. subtilis pCS9 (табл. 1), который использовали для продолжения экспериментов.

1. Протеолитическая активность в культуральной жидкости исследуемых природных изолятов Bacillus и рекомбинантных штаммов с геном субтилизино-подобной сериновой протеиназы B. pumilus aprBp в различных конструкциях ( n = 10)

Штамм      1	Активность, EU        1	Продуктивность, усл. ед
B. pumilus 7Р	1,50±0,02	0,50±0,01*
B. pumilus 7Р/3-19	2,90±0,01	0,93± 0,02 *
B. subtilis pCS9	3,50±0,01	1,14±0,02*
B. subtilis MRB044	0,25±0,05	0,10±0,01
B. subtilis MRB045	0,30±0,02	0,12±0,02
B. subtilis MRB046	0,42±0,03	0,17±0,02*
B. subtilis MRB072	0,50±0,01	0,20±0,04
* Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

2. Очистка рекомбинантной субтилизиноподобной протеиназы, экспрессируемой в штамме Bacillus subtilis pCS9 с геном aprBp B. pumilus в плазмиде pCS9

( n = 5)

Стадия очистки	Объем, мл	Белок, мг/мл	Активность	Степень очистки	Выход, %
			EU/мл п всего, EU1 удельная, EU/мг

Культуральная

жидкость Ионообменная хроматография на карбок-	12800	870±20*	4,4±0,07*	56320а	0,005	1,0	100
симетилцеллюлозе	470	383±10*	33,8±0,1*	15886а	0,088	17,6	28,2

Пи мечание. а — средние значения активности.

* Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

После культивирования B. subtilis pCS9 в биореакторе и очистке протеиназы ее фракции с высокой активностью, полученные при хроматографическом разделении продукта экспрессии, объединили и получили пре- парат с суммарной активностью 15886 EU (табл. 2). Анализ методом SDS-электорофореза подтвердил наличие белка с молекулярной массой 28 кДа. Таким образом, с помощью хроматографии на КМЦ был получен высоко-очищенный препарат рекомбинантной субтилизиноподобной протеиназы в 0,2 М Na-ацетатном буфере (рН 6,3). Так как компоненты буферной смеси нетоксичны для кур, их присутствие в растворе фермента не служило препятствием для использования в экспериментах с птицей.

Температурный оптимум рекомбинантного фермента составил 37 ° С (рис. 1, А). Для практического использования важно, что в присутствии ионов кальция в конечной концентрации 5 мМ температурный оптимум фермента повышался до 50 ° С. При этом активность фермента увеличивалась в среднем на 40 % при 50 ° С и на 60 % — при 55 ° С (см. рис. 1, Б). Протеиназа оставалась стабильной в интервале температуры от 0 до 40 ° С.

Оптимум кислотности для протеиназы приходился на рН 9,5. Протеиназа сохраняла стабильность в интервале рН 7-10. При рН 3 и рН 11 падение активности не превышало 40 % (см. рис. 1, В). Данные по термои рН-стабильности белка свидетельствуют о возможности его применения в качестве кормовой добавки. При разведении аликвоты фермента раствором специфического ингибитора сериновых протеиназ PMSF (1:1000) энзиматическая активность полностью подавлялась, в присутствии ингибиторов металлопротеиназ EDTA и о-фенантролина (соотношение 1:100) — не изменялась. Эти данные свидетельствовали о принадлежности фермента к классу сериновых протеиназ. Активность протеиназы не подавлял ингибитор трипсина, на основании чего мы предположили, что рекомбинантный фермент будет способен функционировать в ЖКТ кур.

Рис. 1. Температурный оптимум (А), термостабильность (Б) рекомбинантной субтилизи-ноподобной протеиназы Bacillus pumilus в отсутствие (1) и в присутствии (2) Са²⁺, а также оптимум (3) и рН-стабильность (4) фермента (В) ( n = 5, различия с контролем статистически значимы при р < 0,05).

лина. Гидролиз β -цепи приводил к

Для исследования субстратной специфичности протеиназы использовали β-цепь окисленного инcу-накоплению многочисленных пептид фрагментов, выявляемых при тонкослойной хроматографии (данные не приведены), что указывало на широкую субстратную специфичность, характерную для известных субтилизиноподобных ферментов — протеиназы К, эсперазы B. lentus и субтилизина BPN´ B. amyloliquefaciens (37). Фермент гидролизует связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот (Phe1-Val2, Leu11-Val12, Leu15-Tyr16, Phe25-Tyr26 и др.), а также гидрофильных аминокислот (Asn3-Gln4, Gln4-His5, Cys7-Gly8, Ser9-His10, Tyr16-Leu17 и др.). Следовательно, полученная протеиназа B. pumilus обладает широкой субстратной специфичностью и способностью к глубокому гидролизу белковых субстратов, что также определяет перспективность фермента как биодобавки, расщепляющей белковые компоненты кормов.

Для эффективной работы в пищеварительном тракте птицы протеиназа должна сохранять активность при повышенной температуре (40 ° С) и агрессивных значениях рН среды, меняющихся от кислого к щелочному. Эксперимент с имитаций условий ЖКТ кур (рН, время и температура) показал, что протеиназа успешно функционирует в таких условиях (рис. 2). В слабокислой среде (рН 5,5, модель «зоб») фермент сохранял активность в пределах контроля. В сильнокислой среде (рН 2,9, модель «желудок») активность фермента снизилась на 40 %, а в щелочных условиях (рН 6,5-8,0, модель «тонкий и толстый кишечник») — возрастала на 10-13 % относительно контроля. Эти данные показали, что протеиназа может оставаться в активном состоянии на всем протяжении пищеварительного тракта птицы.

Рис. 2. Активность рекомбинантной суб-тилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus при различных значениях рН, имитирующих условия в желудочно-кишечном тракте цыплят ( n = 5, различия с контролем статистически значимы при р < 0,05).

Изучение активности и стабильности фермента при воздействии желчью в течение 1 ч при 40 °С показало, что при ее концентрации от 0,01 до 0,05 % активность фермента сохранялась в пределах контроля. При увеличении кон- центрации до 1 % активность фермента снижалась на 10 %, а при концентрации 5 % остаточная активность фермента составила 60 % (рис. 3). Следовательно, полученный бактериальный фермент способен сохранять каталитическую активность при воздействии желчи в условиях ЖКТ кур.

Рис. 3. Активность рекомбинантной субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus при разных концентрациях желчи: а — 0,01 %, б — 0,05 %, в — 0,10 %, г — 0,25 %, д — 0,50 %, е — 1 %, ж — 5 % ( n = 5, различия с контролем статистически значимы при р < 0,05).

При оценке токсичности препарата цыплят содержали в вольерах. Предварительно цыплят осматривал ветеринарный специалист для выявления больных и ослабленных особей (их исключали из эксперимента). Использовали стартовый комбикорм в виде крупки. Рас- ход препарата протеиназы составлял 12,5 мл/кг корма на 15 гол. В течение

10 сут (период наблюдения) все цыплята оставались здоровыми, активными, хорошо поедали корм, физиологических отклонений и изменения поведенческих реакций у них не наблюдали. Живая масса цыплят в опыте сохранялась в пределах контроля. Помет цыплят-бройлеров был нормальный. После вскрытия во внутренних органах цыплят повреждений и патологических изменений не выявили. Эти результаты подтвердили, что препарат бактериальной протеиназы был безопасен для птицы и не обладал токсичностью.

3. Динамика основных зоотехнических показателей у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 при добавлении рекомбинантной протеиназы Bacillus pumilus в корма ( M ±SEM, физиологический опыт, крестьянско-фермерское хозяйство, Республика Марий Эл)

Показатель	Контроль ( n = 25)	I группа, 5 EU/кг корма ( n = 25)	II группа, 15 EU/кг корма ( n = 25)
Прирост живой массы, кг: 0 сут	0,049±0,003	0,049±0,003	0,049±0,003
1-10 сут	0,201±0,007	0,229±0,008	0,214±0,005
11-20 сут	0,364±0,014	0,402±0,014	0,391±0,010
21-42 сут	1,551±0,032	1,668±0,038	1,674±0,039
Итого	2,165±0,044	2,348±0,044	2,328±0,037
Потребление комбикорма в расчете на одного цыпленка, кг:
Старт (0-10 сут)	0,343	0,336	0,347
Рост (11-20 сут)	0,729	0,705	0,719
Финишер (21-42 сут)	3,112	3,127	3,071
Итого	4,184	4,168	4,137
Конверсия корма: Старт (0-10 сут)	1,71	1,47	1,62
Рост (11-20 сут)	2,00	1,75	1,84
Финишер (21-42 сут)	2,01	1,88	1,84
Итого	1,98	1,81	1,82
Сохранность поголовья	100 %	100 %	100 %

П р и м е ч а н и е. В I и II группах к основному (контрольному) рациону добавляли препарат субтили-зиноподобной протеиназы Bacillus pumilus (см. раздел «Методика»). Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

При определении питательной ценности кормов (Рост, Старт, Финишер) в случае добавления бактериальной протеиназы содержание кальция (около 1 %) было достаточным для стабилизации активности вносимого фермента. В течение 42 сут (период наблюдений) все цыплята оставались здоровыми, активными, хорошо поедали корм, их поведенческие реакции не изменялись. Сохранность поголовья составила 100 % в контрольной и опытных группах. К концу откорма живая масса птицы, получавшей протеиназу в качестве добавки, была выше контроля в I группе (5 EU/кг) в среднем на 8,7 % (р < 0,05), во II группе (15 EU/кг) — на 7,7 % (р < 0,05) (табл. 3). В период 0-10 сут (комбикорм Старт) прирост живой массы цыплят в I и II группах был выше, чем в контроле, соответственно на 13,9 % (р < 0,05) и 6,5 % (р < 0,05) (см. табл. 3). Конверсия корма в обеих группах улучшилась (соответственно на 14,0 и 5,3 %, р < 0,05). С 11-х по 20-е сут (комбикорм Рост) прирост массы в I группе был выше на 10,4 % (р < 0,05), во II группе — на 7,4 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. При этом конверсия корма улучшалась (соответственно на 12,5 и 8,0 %, р < 0,05). При использовании комбикорма Финишер (21-42-е сут) наблюдали прирост в I группе на 7,5 % (р < 0,05), во II — на 7,9 % (р < 0,05). В этот период конверсия корма в опытных группах улучшалась соответственно на 6,5 и 8,5 % (р < 0,05).

Таким образом, субтилизиноподобная протеиназа Bacillus pumilus, экспрессируемая в клетках Bacillus subtilis pCS9 с геном aprBp в составе плазмиды pCS9, проявляет широкую субстратную специфичность, стабильна (выдерживает колебания pH, температуры, высокие концентрации желчи), высокоактивна (способна сохранять активность как в верхних, так и в нижних отделах кишечника цыплят кросса Cobb 500) и нетоксична для птицы. Эти свойства препарата необходимы в условиях желудочнокишечного тракта бройлеров, поскольку фермент должен удалять субстраты, которые могли бы нарушить пищеварение и баланс микрофлоры, по мере продвижения химуса по всему кишечнику. Полученные данные позволили нам сделать заключение, что на ранних стадиях роста (0-10 сут) при использовании рецептуры Старт эффективная доза протеиназы — 5 EU/кг корма (проявляется тенденция к улучшению конверсии корма). То же отмечали позднее (21-42-е сут) при добавлении протеиназы в дозе 15 EU/кг к комбикорму Финишер. Полученная рекомбинантная бациллярная протеиназа может рассматриваться как потенциальная кормовая добавка для повышения прироста живой массы и снижения потребления корма при выращивании цыплят-бройлеров.

Л И Т Е Р А Т У Р А

ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный        Поступила в редакцию университет, Институт фундаментальной               19 сентября 2018 года медицины и биологии,

420008 Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18,

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2018, V. 53, ¹ 6, pp. 1274-1284

GENE CONSTRUCT-BASED SERINE PROTEASE OF Bacillus pumilus AS A FEED ADDITIVE FOR POULTRY FARMING

A.O. Koryagina, N.L. Rudakova, M.T. Lutfullin, G.F. Khadieva, A.A. Toymentseva, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova

The authors declare no conflict of interests

Acknowledgements:

This work is a part of the State Program to improve the world research and education competitiveness of the Kazan

(Volga Region) Federal University

Supported financially by Russian Science Foundation (science project No. 16-16-04062)