Протекторное действие пробиотика на морфофункциональные показатели печени цыплят-бройлеров при индуцированной энтрофлоксацином гепатопатии

Введение. Применение антибактериальных препаратов в промышленном птицеводстве, традиционно используемых для контроля инфекционных заболеваний и стимуляции роста, сопряжено с развитием резистентности у патогенов, риском накопления остатков в продукции и потенциальным гепатотоксическим действием, поскольку печень является основным органом метаболизма ксенобиотиков [1, 2]. Ужесточение законодательства в области ветеринарного применения антибиотиков (Федеральный закон № 636-ФЗ от 21.11.2022 «О внесении изменений в Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств» и отдельные законодательные акты Российской Федерации») актуализирует поиск эффективных альтернативных и комплементарных средств, направленных на поддержание здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных без рисков, ассоциированных с антимикробными препаратами. Мировой опыт показывает, что пробиотики на основе Bacillus subtilis являются одной из наиболее перспективных альтернатив, что подтверждается многочисленными обзорами [3]. Ранее проведённые нами пилотные исследования на птице яичного кросса [4] выявили позитивное влияние исследуемого пробиотического штамма на отдельные биохимические и морфологические параметры печени. Однако физиология и интенсивность метаболических процессов у бройлеров принципиально иные, что определяет необходимость отдельного целенаправленного изучения.

Цель исследования - провести сравнительный анализ влияния антибиотика энрофлокса-цина и пробиотика на основе штамма Bacillus subtilis на морфофункциональные показатели печени цыплят-бройлеров.

Условия, материалы и методы. Эксперимент проведён на базе Лаборатории птицеводства Белгородского государственного аграрного университета имени В.Я. Горина. В качестве объекта исследования использованы цыплята-бройлеры кросса «Росс-308» в общем количестве 100 голов. Эксперимент проводили с цыплятами с 1-х по 21-е сутки жизни.

Все цыплята были разделены на 4 группы (n=25), для каждой была подобрана схема кормления:

Контрольная группа: стандартный рацион (зерно, комбикорм, вода);

Группа с пробиотиком: стандартный рацион + выпаивание пробиотиком (штамм Bacillus subtilis ВКМ В3701D) в дозе 1 г/кг массы тела (1 г содержит 109 КОЕ) ежедневно с 1‑х по 20-е сутки жизни;

Группа с антибиотиком: стандартный раци- он + выпаивание энрофлоксацином в дозе 200 мг/л воды в первые 5 суток жизни;

Группа с антибиотиком и пробиотиком: стандартный рацион + выпаивание энрофлок-сацином (200 мг/л) в первые 5 суток жизни, затем с 6‑х по 20‑е сутки жизни – пробиотик (штамм Bacillus subtilis ВКМ В3701D) в дозе 1 г/кг массы тела.

Убой цыплят производили на 1‑е, 7‑е, 14‑е и 21‑е сутки жизни для изучения гистологических и морфометрических показателей печени по 6 особей из каждой группы на каждом сроке. В эти же сроки измеряли массу тела птиц и массу печени.

Извлечённые органы после макроскопического исследования и взвешивания фиксировали в 10%‑м растворе забуференного нейтрального формалина для последующего гистологического анализа.

Для гистологического исследования проводка образцов выполнялась с использованием батареи из этилового спирта и хлороформа с последующей парафинизацией при помощи аппарата для гистологической обработки биологических тканей TLP-144 (MT Point Technology, Россия). Заливку блоков со стандартной ориентацией кусочков проводили на станции для заливки биологического материала ESD-2800-M (MT Point Technology, Россия). Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на полуавтоматическом ротационном микротоме с системой транспортировки и расправления срезов RMD-3000 (MT Point Technology, Россия). Окраску осуществляли гематоксилином и эозином (Labiko, Россия).

Основная часть морфологического исследования выполнена после создания электронной галереи изображений с помощью полуавтоматического сканера микропрепарата Mirax Desk (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия), что позволило максимально стандартизовать режимы морфометрического исследования. Увеличение сканирующего объектива составило ×20. Цифровое увеличение на микрофотографиях и изображениях при анализе варьировало от ×20 (при отсутствии про- граммного увеличения) до ×800 (при 40-кратном программном увеличении).

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы SPSS Statistics 17.0. Нормальность распределения количественных признаков в группах проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения показателей между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Тьюки для данных, имеющих нормальное распределение и равные дисперсии. В случае отклонения от нормальности распределения использовали непараметрический критерий Краскела_Уоллиса с последующим попарным сравнением по критерию Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Исследование проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

Результаты и обсуждение. Применение энрофлоксацина (группа 3) оказывало угнетающее влияние на динамику живой массы цыплят-бройлеров в период интенсивного роста. К 14‑м суткам жизни живая масса птиц в этой группе (479,02 ± 18,10 г) была статистически значимо ниже (p<0,05), чем в контрольной группе (507,72 ± 7,71 г). Однако к 21‑м суткам эта разница нивелировалась, и масса тела птиц в группе 3 (982,68 ± 25,83 г) не отличалась от контрольных значений (968,74 ± 21,49 г). В группе с комбинированным применением антибиотика и последующим пробиотиком (группа 4) к 21‑м суткам зафиксировано достоверное снижение (p<0,001) живой массы (882,21 ± 24,28 г) относительно всех других групп, что может быть связано с фазой восстановительных процессов и перераспределением метаболических ресурсов на репарацию в печени (таблица).

Таблица – Динамика относительного прироста живой массы и массы печени цыплят (n=6)

Сутки жизни	1-я группа: Контроль	2-я группа: Пробиотик	3-я группа: Антибиотики	4-я группа: Пробиотик и антибиотики
Абсолютная масса печени, г
1	1,62 ± 0,14
7	6,48 ± 1,18	6,18 ± 0,87	6,05 ± 0,71	6,01 ± 0,59
14	15,91 ± 3,08	17,73 ± 1,76	16,27 ± 1,84	15,82 ± 1,62
21	25,90 ± 3,54	25,83 ± 2,66	28,92 ± 4,38*	27,72 ± 1,60
Масса птицы, г
1	42,47 ± 2,29
7	157,75 ± 3,74	155,36 ± 3,27	151,75 ± 4,53	150,22 ± 5,64
14	507,72 ± 7,71	508,24 ± 11,28	479,02 ± 18,10*	475,05 ± 6,13**
21	968,74 ± 21,49	980,16 ± 17,81	982,68 ± 25,83	882,21 ± 24,28***

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 (между контрольной и опытными группами)

Что касается абсолютной массы печени, статистически значимое увеличение (p<0,05) этого показателя к 21‑м суткам наблюдали только в группе птиц, получавших антибиотик (28,92 ± 4,38 г против 25,90 ± 3,54 г в контроле). Это может косвенно указывать на развитие компенсаторно-приспособительных реакций органа в ответ на гепатотоксическую нагрузку [5]. Помимо микроциркуляторных нарушений, энрофлокса-цин способен модулировать активность микросомальных ферментов печени, что также может вносить вклад в развитие гепатопатии [6].

Достоверное снижение живой массы у цыплят-бройлеров в группе 4 на 21-е сутки (p<0,001), вероятно, обусловлено перераспределением метаболических ресурсов с процессов линейного соматического роста на энергоёмкие репаративные реакции в гепатобилиарной системе, индуцированные пробиотиком на фоне постантибиотической нагрузки [7, 8]. Морфологическим подтверждением этой гипотезы служит значимо меньшая выраженность центролобулярного полнокровия у птиц этой группы на 14‑е сутки (28,6% против 50,0% в группе изолированного применения энрофлоксацина), что свидетельствует об активной фазе восстановления микро- циркуляторного русла и паренхимы печени. Кроме того, отсутствие компенсаторной гепатомегалии (27,72±1,60 г против 28,92±4,38 г в группе 3) указывает на противовоспалительное действие Bacillus subtilis, нивелирующее гипертрофические реакции. Зафиксированное снижение массы тела носит транзиторный адаптационновосстановительный характер и отражает физиологическую «цену» гепатопротекции. Современные транскриптомные исследования показывают, что пробиотики Bacillus subtilis способны модулировать экспрессию генов в печени, подавляя провоспалительные сигнальные пути и активируя метаболические процессы репарации [9].

При гистологическом исследовании структура паренхимы печени цыплят-бройлеров всех групп в возрасте 1-х суток имела гомогенный незрелый вид, печеночные балки были неразличимы, синусоиды различались с трудом. Цитопл-зама гепатоцитов была тотально заполнена оптически прозрачными везикулами, ядра были округлыми, везикулярными с мелкодисперсным хроматином. Центральные вены и портальные тракты определялись отчетливо, вокруг последних отмечался умеренный периваскулярный отек (рис. 1).

Рисунок 1 — Паренхима печени 1-суточного цыпленка-бройлера перед разделением на группы: 1 - центральная вена; 2 - ветвь портальной вены в составе портального такта Гематоксилин+эозин, х100.

При микроскопии препаратов печени 7-суточных цыплят-бройлеров гистоархитектоника имела более зрелый вид, визуализировались печеночные балки и синусоиды. Цитоплазма гепатоцитов была неоднородная, ацидофильная с неравномерно расположенными оптически про- зрачными вакуолями. Ядра сохраняли везикулярный вид и округлую форму. Центральные вены и портальные тракты определялись отчетливо. В интерстициальном пространстве обнаруживали одиночные островки миелоидной ткани – очаги экстамедуллярного гемопоэза (рис. 2).

Рисунок 2 — Паренхима печени 7-суточного цыпленка-бройлера 1 группы: 1 - очаги экстрамедуллярного кроветворения. Гематоксилин+эозин, х100.

К 14-м суткам строение паренхимы печени цыплят-бройлеров приобретало типичное для печени трабекулярное строение с радиально направленными трабекулами вокруг центральных вен (рис. 3). Цитоплазма гепатоцитов была слабо зернистой, менее ацидофильной, без крупных везикул. Ядра гепатоцитов были округлыми, везикулярными или пикнотиче-скими. Сохранялись интерстициальные очаги экстрамедуллярного кроветворения.

Рисунок 3 — Паренхима печени 14-суточного цыпленка-бройлера из 3 группы (энрофлоксацин):

1 – центральная вена; 2 – периваскулярный очаг экстрамедуллярного кроветворения.

Гематоксилин+эозин, ^100.

При этом в 50% гистологических препаратов птиц 3 группы отмечалась тенденция к центролобулярному полнокровию. Синусоиды в центральных отделах печёночных долек были расширены и заполнены ядерными эритроцитами (рис. 4).

Рисунок 4 — Паренхима печени 14-суточного цыпленка-бройлера из группы 3 (энрофлоксацин); полнокровие синусоид в центральных отделах дольки (справа): 1 – портальный тракт;

2 - скопления эритроцитов в синусоидах; 3 - центральная вена. Гематоксилин+эозин, х100.

У цыплят группы 4 также было выявлено полнокровие паренхимы, однако его выраженность была значительно ниже, а доля гистологических препаратов с полнокровной печенью составила 28,6%

(рис. 5).

Рисунок 5 — Паренхима печени 14-суточного цыплёнка-бройлера из группы 4 (энрофлоксацин + пробиотик); умеренное полнокровие синусоид: 1 – небольшие скопления эритроцитов в синусоидах; 2 - очаги экстрамедуллярного кроветворения. Гематоксилин+эозин, ^100

Строение паренхимы печени цыплят-бройлеров 21-суточного возраста не имело значительных отличий от строения печени 14-суточных животных. Трабекулы оставались отчетливыми, разделяющие их синусоиды формировали сосудистую сеть, пронизывающую все дольки. Цитоплазма гепатоцитов была умеренно ацидофильной, гомогенной или слабо зернистой. Ядра гепатоцитов были округлыми и везикулярными с зернистым хроматином или пикнотическими. Отмечали незначительную перипортальную лимфоидную инфильтрацию (рис. 6). Значимых различий при микроскопии между группами выявлено не было.

Рисунок 6 — Паренхима печени 21-суточного цыплёнка-бройлера 3 группы; незначительная перипортальная лимфоидная инфильтрация: 1 – вены портального тракта; 2 – периваскулярные лимфоидные скопления. Гематоксилин+эозин, *100

Таким образом, результаты морфогистологического исследования подтверждают, что энрофлоксацин индуцирует преходящие нарушения микроциркуляции в печени бройлеров по типу центролобулярного полнокровия, пик которых приходится на 14-е сутки. Последующее применение пробиотика на основе Bacillus subtilis ВКМ В3701D демонстрирует выраженный протекторный потенциал, значимо снижая частоту и выраженность этих патологических изменений, что обосновывает целесообразность его включения в схемы выращивания птицы для коррекции медикаментозных гепатопатий. Полученные результаты согласуются с исследованиями других авторов, показавших, что штаммы Bacillus subtilis снижают окислительный стресс и повреждение печени у бройлеров при воздействии токсинов [10].

Выводы. Применение энрофлоксацина у цыплят-бройлеров вызывает транзиторные микроциркуляторные нарушения в печени в виде центролобулярного полнокровия, достигающие максимума к 14‑м суткам жизни, что выявлено в 50% гистологических препаратов.

Включение пробиотика на основе Bacillus subtilis ВКМ В3701D в схему после курса эн-рофлоксацина достоверно снижает частоту (до 28,6%) и выраженность центролобулярного полнокровия на 14‑е сутки, что свидетельствует о его гепатопротекторном действии.

К 21‑м суткам жизни морфологические изменения печени во всех группах нивелируются, что указывает на высокие репаративные способности гепатобилиарной системы цыплят-бройлеров.

Комбинированное применение энрофлокса-цина и пробиотика сопровождается временным снижением живой массы к 21-м суткам -до 882,21±24,28 г против 968,74±21,49 г в контроле (p<0,001), что, вероятно, связано с перераспределением ресурсов на восстановительные процессы в печени.