Протеомные аспекты созревания твердых и мягких сыров

Протеомные аспекты созревания сыров включают сложный ферментативный распад молочных белков, что приводит к образованию пептидов с различной молекулярной массой, свободных аминокислот, аммиака и других азотсодержащих соединений, которые формируют вкус, аромат, текстуру и являются основой для дальнейшего липолиза и гликолиза, определяя органолептические свойства сыра.

Изменчивость протеома молока, структура, функции и взаимодействие белков в зависимости от множества факторов представляет интерес для исследователей на протяжении многих десятилетий [1-5]. И в настоящее время интерес научного сообщества к этим исследованиям не только не исчезает, но и усиливается из-за появления новых методических возможностей [6].

Применительно к сыроделию использование методов протеомики, основанных на разделении и идентификации белков, пептидов и аминокислот, позволяет более глубоко исследовать изменение белков в ходе созревания сыра, оценить степень зрелости, идентифицировать белковый состав сыров различных видов, проверить их аутентичность (важно в аспекте фальсификации белкового состава) и видовую принадлежность, установить закономерности протекания протеолиза в зависимости от различных (биохимических, микробиологических, технологических) факторов. Это позволяет рассматривать методы протеомики как важный инструмент для контроля качества, аутентификации и направленного формирования органолептических свойств сыров.

Многообразие технологий производства сыров предполагает различную продолжительность процесса созревания: от трех суток до трех и более лет. Сыры с высокой степенью зрелости требуют к себе особого внимания и ухода с целью получения продукта с уникальными для каждого вида сыра органолептическими показателями. Длительность и трудоемкость процесса изготовления созревающих сыров обуславливает их более высокую стоимость. В связи с этим особую актуальность приобретают вопросы идентификации различных видов сыров, отличающихся степенью зрелости. Например, такая проблема может возникнуть при присвоении сырам наименования места происхождения товара, а также при таможенном декларировании и таможенном контроле экспортируемых или импортируемых сыров [7].

Основу отечественного ассортимента сыров составляют полутвердые сыры, которым россияне традиционно отдают предпочтение. Наряду с ними в последние годы растет интерес к твердым и мягким сырам, что стало стимулом для увеличения объема их производства [8, 9]. Твердые и мягкие сыры существенно отличаются друг от друга технологией изготовления, в том числе условиями созревания, которые предполагают достижение различных уровней протеолиза и состава его продуктов. Это можно использовать как один из отличительных видовых признаков, что было подтверждено исследованиями турецких [10] и российских [11] ученых. Но таких исследований явно недостаточно.

В задачи исследований входило на примере твердых и мягких сыров установить различия в протекании протеолиза на основе сравнительного анализа пептидных профилей с целью выявления наличия пептидных маркеров для видовой идентификации сыров.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были сыры, относящиеся к двум видовым группам – твердые и мягкие. Группу твердых сыров представляли Пармезан и Кальвет, группу мягких – Славянский и Брынза.

Изменения в количественном и качественном составе продуктов протеолиза оценивали по пептидным профилям, которые получали методом эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации высокого разрешения) на приборе AKTA pure 25 (Швеция) с использованием хроматографической колонки Superose 6 Increase 10/300 GL (Cytiva, Швеция) c диапазоном фракционирования 1-5000 кДа. Состав элюента: водный раствор 0,05М Na2HPO4 и 0,15М NaCl, скорость подачи элюента - 0,5 см3/мин. Детектирование пептидов осуществлялось УФ-детектором с длиной волны 280 нм.

Метод эксклюзионной хроматографии позволяет дифференцировать по молекулярной массе водорастворимые продукты протеолиза и оценить их молекулярно-массовое распределение.

Количественную оценку распределения продуктов протеолиза проводили по площадям пиков, соответствующих пептидам с разной молекулярной массой. Для этого все выявленные пептиды были разде лены по молекулярным массам на три фракции: высокомолекулярную

(более 10 кДа), среднемолекулярную (от 2 до 10 кДа) и низкомолекулярную (менее 2 кДа).

Площади пиков выражали в условных единицах min·mAu, представляющих собой произведение единиц времени (min, ось Х) на единицы оптического поглощения (mAu, ось У). Молекулярно-массовое распределение (в %) рассчитывалось компьютерной программой, исходя из количества каждой фракции.

Математическую обработку результатов проводили, используя методы описательной статистики и однофакторного дисперсионного анализа по программе Microsoft Excel 2010.

Результаты исследований и их обсуждение

Твердые сыры. Особенности процесса созревания твердых сыров во многом обусловлены его длительностью. Для них характерна низкая влажность и высокая массовая доля белка, в связи с чем протеолитические процессы при созревании протекают медленней, чем в сырах с высоким содержанием влаги – мягких и полутвердых. Типичным представителем твердых сыров является Пармезан.

На рисунке 1 показано изменение количества продуктов протеолиза с различной молекулярной массой в твердом сыре Пармезан за 12 месяцев созревания (средние значения по 3 повторностям).

Количество в min■ mAU

■ Высокомолекулярные ■ Среднемолекулярные «Низкомолекулярные

Рисунок 1 – Изменение количества продуктов протеолиза с различной молекулярной массой при созревании сыра Пармезан

Из представленных данных следует, что к концу наблюдаемого срока созревания в сыре Пармезан существенно увеличилось количество низкомолекулярной фракции, в которую входят пептиды и свободные аминокислоты с молекулярной массой менее 2 кДа. По сравнению с началом созревания к 12-месячному возрасту оно возросло более чем в 7 раз и составило в общем количестве продуктов протеолиза около

■ Низкомолекулярные

Среднемолекулярные

■ Высокомолекулярные

Рисунок 2 – Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в сыре Пармезан в разные сроки созревания

Образование большого количества продуктов протеолиза с молекулярной массой менее 2 кДа объясняет присущий Пармезану насыщенный вкус, для которого характерны пикантность в сочетании со сладковатыми фруктовыми и ореховыми оттенками.

Среднемолекулярная фракция, к которой относятся пептиды с молекулярными массами от 2 до 10-15 кДа, в сыре Пармезан была представлена пептидами в диапазоне молекулярных масс от 1 до 3,5 кДа. Примечательно, что в ней отсутствовали пептиды с молекулярными массами от 3,5 до 15 кДа. Это, а также наблюдаемый прирост низкомолекулярной фракции говорит об активном вторичном протеолизе, катализируемом, в основном, ферментами заквасочных микроорганизмов.

Присутствие высокомолекулярной фракции, состоящей из крупных фрагментов казеина и полипептидов, свидетельствует о продолжающемся первичном протеолизе, который происходит, в основном, под действием остаточного сычужного фермента. В абсолютных единицах (m·mAU) эта фракция по мере созревания сыра количественно увеличивалась (рисунок 1), Но в общем объеме продуктов протеолиза к концу созревания доля высокомолекулярной фракции уменьшалась (рисунок 2).

В отличие от Пармезана твердый сыр Кальвет считается зрелым при достижении 3-месячного возраста, после чего он может храниться, продолжая созревать, до 12 месяцев. Технология этого сыра не предусматривает продолжительности созревания более 1 года, поэтому его консистенция не приобретает зернистости, как у выдержанного Парме- зана, а характеризуется как эластичная, с допускаемой легкой крош-ливостью, хорошо разрезаемая на ломтики.

На рисунке 3 показано изменение в процессе созревания сыра Кальвет количества высокомолекулярных (синяя линия), среднемолекулярных (красная линия) и низкомолекулярных (зеленая линия) продуктов протеолиза пептидного пула водорастворимой фракции.

Рисунок 3 – Изменение количества продуктов протеолиза с различной молекулярной массой при созревании сыра Кальвет

Высокомолекулярные пептиды на протяжении всего срока созревания сыра Кальвет по молекулярным массам входили в диапазон от 16 до 60 кДа. По мере созревания сыра в течение 6 месяцев их количество увеличилось почти в 2 раза. Это говорит о достаточно высокой активности первичного протеолиза, т.к. количество высокомолекулярных пептидов росло, несмотря на параллельно протекающий вторичный протеолиз, в результате которого они распадались на более мелкие среднемолекулярные пептиды.

Среднемолекулярные пептиды являются «промежуточной» фракцией между высокомолекулярными и низкомолекулярными. Их количество как растет за счет распада высокомолекулярных пептидов, так и уменьшается за счет преобразования в низкомолекулярные вследствие вторичного протеолиза. В какое-то время может установиться динамическое равновесие, когда количество вновь образующихся среднемолекулярных пептидов будет равно количеству распадающихся. Судя по данным, представленным на рисунке 3, такое равновесие существовало на протяжении первых трех месяцев созревания. Неизменяющееся количество среднемолекулярных пептидов в этот период говорит об одинаковой скорости распада высокомолекулярных пептидов до сред- немолекулярных и среднемолекулярных – до низкомолекулярных. За это время количество низкомолекулярных продуктов протеолиза увеличилось в 1,3 раза.

После трех месяцев созревания количество среднемолекулярных пептидов стало уменьшаться, на 5-6 месяцы они не были выявлены, в то время как низкомолекулярные продукты протеолиза показали увеличение в 1,7 раза. Следовательно, на 5-6 месяцы созревания сыра Кальвет преобладающим процессом стало преобразование среднемолекулярных пептидов в низкомолекулярные.

В последний (седьмой) наблюдаемый месяц созревания произошло небольшое снижение количества высокомолекулярных пептидов, увеличение среднемолекулярных и такое же снижение низкомолекулярных. Очевидно, что в этот период стал преобладать первичный протеолиз.

Полученные результаты иллюстрируют динамичность процесса протеолиза в твердых сырах при созревании, когда происходит постоянная смена состояния протеома, влияющая на текстуру, вкус и аромат продукта вследствие образования продуктов протеолиза с различной молекулярной массой.

Мягкие сыры. Ассортимент отечественных мягких сыров включает как сыры без созревания, так и созревающие сыры.

Славянский – мягкий сыр без созревания со сроком годности 10 суток. Его особенностью является присутствие в составе заквасочной микрофлоры бифидобактерий, что обуславливает принадлежность Славянского сыра к функциональным продуктам питания.

Отсутствие созревания в технологии сыра Славянский не предполагает активного развития протеолитических процессов. Но при хранении в пределах срока годности они происходят. Это иллюстрируется изменением количества продуктов протеолиза в течение 6 суток (рисунок 4).

■ Высокомолекулярные ■ Среднемолекулярные ■ Низкомолекулярные

Рисунок 4 – Изменение количественного распределения пептидных фракций при хранении сыра Славянский

Из данных, представленных на рисунке 4, следует, что даже в непродолжительный период времени в сыре Славянский происходит перераспределение пептидов по молекулярной массе от исходных высокомолекулярных пептидов к более мелким продуктам их протеолиза.

За 6 суток произошло уменьшение количества высокомолекулярной фракции при соответствующем увеличении среднемолекулярной. Низкомолекулярная фракция также количественно увеличилась, но незначительно.

Общее количество водорастворимых продуктов протеолиза за 6 суток хранения увеличилось на 4-5 %.

Во всех исследованных сырах присутствовали в небольшом количестве (2-3 %) крупные фрагменты белков с молекулярными массами более 90 кДа, которых не было в твердых сырах. Кроме них высокомолекулярная фракция содержала полипептиды с молекулярными массами от 10 до 50 кДа.

Среднемолекулярная фракция содержала пептиды с молекулярными массами от 3 до 10 кДа и в 6-суточном сыре по количеству была максимальна (рисунок 5).

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

Низкомолекулярные

Среднемолекулярные

Высокомолекулярные

Рисунок 5 – Молекулярно-массовое распределение продуктов протеолиза в свежем сыре Славянский (0 суток) и после 6 суток хранения

Внутри группы среднемолекулярных пептидов в 2 раза увеличилось количество пептидов с молекулярными массами от 2 до 3,5 кДа при соответствующем уменьшении более крупных (от 3,5 до 10 кДа).

Содержание низкомолекулярных пептидов и аминокислот с молекулярными массами менее 2 кДа было минимальным и составляло в свежем сыре 5% от общего количества пептидных фракций. Через 6

суток хранения их количество увеличилось на 2 %.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в сыре Славянский активно протекают протеолитические процессы, преобладающим из которых является первичный протеолиз.

Было отмечено, что после достижения срока годности (10 суток) консистенция сыра теряла упругость и становилась пластичной и мажущейся. Это подтверждает существенные изменения, происходящие с белковой матрицей, связанные с протеолизом.

Одной из причин активного протеолиза в Славянском сыре, очевидно, является высокое содержание влаги (57-58 %), что создает благоприятные условия для гидролитических процессов. Помимо того, что вода является их обязательным участником, ее высокое содержание в продукте облегчает доступ протеолитических ферментов к белкам.

Брынза относится к мягким сырам, созревающим в рассоле. Продолжительность созревания Брынзы в рассоле составляет 5 суток, после чего ее обсушивают, упаковывают и реализуют. В вакуумной упаковке Брынза может храниться до 30 суток. Другой вариант – хранение Брынзы в рассоле. В этом случае срок ее годности составляет 50 суток. В настоящей работе рассмотрен первый вариант процесса, когда Брынза поступает в реализацию после созревания в рассоле в течение 5 суток и хранится упакованной под вакуумом.

Изменение количественного распределения продуктов протеолиза с различной молекулярной массой при созревании и хранении Брынзы представлено на рисунке 6 в абсолютных значениях площадей пиков (min·mAu), на рисунке 7 – в виде процентного соотношения количества фракций (относительные значения).

Рисунок 6 – Количественное распределения продуктов протеолиза при созревании и хранении сыра Брынза (в min·mAu)

Рисунок 7 – Молекулярно-массовое распределение продуктов протеолиза при созревании и хранении сыра Брынза

■ менее 1 кДа

■ 1-3,5 кДа

■ 3,5-10 кДа

■ 10-25 кДа

■ 25-40 кДа

■ 40-200 кДа

Анализ полученных данных показал, что с момента изготовления сыра до окончания срока хранения через 45 суток общее количество образующихся при протеолизе пептидных фракций увеличилось на 45 %. Во время посолки (0-5 суток) прирост произошел на 15 % за счет увеличения количества высокомолекулярных фракций, что является признаком первичного протеолиза. Но внутри фракции среднемолекулярных пептидов произошли изменения, выражающиеся в исчезновении фракции с меньшими молекулярными массами (1-3,5 кДа) при соответствующем увеличении количества более крупных пептидов с молекулярными массами 3,5-10 кДа. Конкретно речь идет о пептидах с молекулярными массами около 2,9 кДа и 3,9 кДа, которые присутствовали в сыре после пресса и составляли около 20 % от общего количества пептидов. После посолки обнаруживались только пептиды с молекулярной массой около 3,9 кДа, но в количестве, близком к сумме определенных ранее отдельных пептидов – 34-35 %.

Наблюдаемое изменение может быть связано с укрупнением отдельных пептидов из-за влияния соли на их гидратированность, вследствие чего они денатурируют, образуя агрегаты, что приводит к увеличению молекулярных масс. При последующем хранении (в 10 и 45 суток) пептиды с молекулярной массой 3,9 кДа уже не выявлялись, а присутствовали только пептиды с молекулярными массами 2,8-2,9 кДа, которые составляли около 28 % от общего количества.

Количество низкомолекулярной фракции за 10 суток практически не изменилось. Только к 45 суткам, когда был превышен срок годно Молочнохозяйственный вестник, №2 (62), II кв. 2026 177

сти, эта фракция увеличилась в 2,5 раза. Увеличение фракции низкомолекулярных пептидов было сопряжено с ухудшением консистенции Брынзы. Она потеряла упругость и приобрела нехарактерную для нее пластичность.

При сравнении свежих, только что изготовленных сыров Славянского и Брынзы было отмечено практически одинаковое распределение пептидных фракций по молекулярным массам, которое можно считать фоновым. Так, в обоих сырах белки с молекулярными массами 40-200 кДа составляли 6-8 % от общего количества выявленных на хроматограмме; высокомолекулярные пептиды (25-40 кДа) – порядка 12-14 %; пептиды с молекулярными массами 10-25 кДа – около 30%. Наибольшую часть всех пептидных фракций (35-40 %) составляли среднемолекулярные пептиды с молекулярными массами от 1 до 10 кДа с приблизительно равным распределением по группам с молекулярными массами 3,5-10 кДа и 1-3,5 кДа. Низкомолекулярные пептиды и свободные аминокислоты с молекулярными массами менее 1 кДа количественно составляли 5-7 % от всех фракций. По мере созревания и хранения сыров наблюдалось перераспределение пептидных фракций по молекулярным массам вследствие протеолиза, имеющее особенности, которые были обусловлены различиями технологий изготовления.

Выводы

Методом эксклюзионной хроматографии проведены исследования изменений пептидного пула твердых и мягких сыров при созревании и хранении. Выявлены межвидовые и внутривидовые различия, обусловленные особенностями технологии изготовления, и установлена принципиальная возможность идентификации зрелых сыров по пептидным профилям.

Сравнительный анализ протеолиза в твердых сырах Пармезан и Кальвет выявил две различные стратегии ферментативной деградации белков. Пармезан характеризовался устойчивым доминированием вторичного протеолиза, ведущим к накоплению низкомолекулярных пептидов и аминокислот (80 % от пула), что коррелирует с пикантным вкусом и зернистой текстурой. Кальвет демонстрировал неравномерность стадий протекания протеолиза. В первые три месяца созревания отмечено равновесие первичного и вторичного протеолиза, на 5-6 месяц вторичный протеолиз временно исчерпывал субстрат (среднемолекулярные пептиды заканчивались), и процесс тормозился. К седьмому месяцу после накопления нового пула высокомолекулярных пептидов первичный протеолиз снова активизировался.

Маркерами зрелости Пармезана можно считать отсутствие пептидов с молекулярными массами от 3,5 до 15 кДа и долю низкомолекулярной фракции в общем количестве продуктов протеолиза более 80 %. Для Кальвета – начало снижения среднемолекулярной фракции по- сле трех месяцев созревания, что можно рассматривать как сигнал к дегустационной оценке готовности.

В мягких сырах без созревания с высоким содержанием влаги (Славянский) отмечено активное протекание протеолиза во время хранения, характеризующееся увеличением в 2 раза количества пептидов с молекулярными массами от 1 до 3,5 кДа при соответствующем уменьшении более крупных (от 3,5 до 10 кДа). Для них характерен умеренный первичный протеолиз без накопления низкомолекулярных продуктов распада в пределах срока годности.

В мягких сырах, созревающих в рассоле (Брынза), выявлены особые изменения в составе среднемолекулярных пептидов, выражающиеся в исчезновении сразу после посолки фракции с меньшими молекулярными массами (1-3,5 кДа) при соответствующем увеличении количества более крупных пептидов (3,5-10 кДа), что может быть связано с укрупнением отдельных пептидов из-за влияния соли на их ги-дратированность. Для них характерен отсроченный вторичный протеолиз, запускающийся после разрушения солевых агрегатов.

Маркером мягких сыров без созревания является наличие в пептидном профиле высокомолекулярных полипептидов с молекулярными массами 90 кДа и более.

Практическая значимость работы: контроль молекулярно-массового распределения пептидов может использоваться как объективный критерий для: оценки степени зрелости сыров; прогнозирования остаточного срока годности; выявления ранних признаков порчи консистенции.