Разработка антигенного иммуноферментного конъюгата для выявления антител к вирусу классической чумы свиней методом ИФА

Классическая чума свиней (КЧС) – это высококонтагиозное вирусное заболевание, которое является предметом особого контроля государственных и ветеринарных служб во всем мире [5, 6, 2]. Диагностика КЧС осуществляется на основании выявления антигена и антител. Для определения вирусоспецифических антител существуют различные варианты непрямого и прямого сэндвич ИФА, которые используют антивидовые антитела, меченые ферментом. Но эти методы многостадийны, имеется узковидовая зависимость, требуется значительное время (18-20 часов) для анализа и из-за повышенного фона оптической плотности двойных антител снижается чувствительность метода [3, 1, 7, 8].

Целью нашей работы являлась усовершенствование тест-системы на основе ИФА для выявления вирусоспецифических антител в сыворотке крови свиней с использованием безопасного в инфекционном отношении аттенуированной вирусовакцины ЛК-ВНИИВВиМ.

Материалы и методы. Для получения специфического антигенного конъюгата использовали вирусвакцину против чумы свиней ЛК-ВНИИвВиМ из штамма «К» (ТУ46-21-796-78) и фермент периоксидазы из корней хрена производства Великобритании.

Для конъюгирования антигена вируса КЧС с ферментом проводили активирование углеводных остатков фермента пероксидазы до альдегидных форм периодатным методом по M.Wilson, P. Nakane (1978). К раствору активированного фермента (20 мг/мл) добавляли различные концентрации от 10 до 50 мг белка культурального вакцинного вируса КЧС. Для оптимальной конъюгации и восстановления иминовой связи добавляли боргидрит натрия. Все условия, необходимые для оптимального соотношения фермента и вирусного белка в конъюгате найдены опытным путем.

Испытание полученного конъюгата фермента с антигеном вируса КЧС проводили прямым ИФА в модификации Г.Ф. Ильясовой и др. (2003), в основе которого лежит прямая иммобилизация антител на полистириловых планшетах (без предварительного адсорбции антигена) и выявление их с помощью антигенного пероксидазного конъюгата вместо антивидового меченного пероксидазой глобулина.

Титром диагностического конъюгата считали то максимальное его разведение которое еще выявляло специфические антитела в наивысшем разведении сыворотки. Визуально результат учитывали по разнице окраски субстрата в лунках, содержащих специфические антитела к вирусу КЧС, в сравнении с окраской субстрата в лунках с отрицательными (гетерологичными) сыворотками.

При инструментальном учете результат реакции считали положительным, если отношение оптической плотности субстрата со специфическими сыворотками к вирусу КЧС к оптической плотности субстрата с отрицательными составляет 2,1 и больше.

Результаты исследований.

Полученными данными показана принципиальная возможность конъюгирования специфического антигена вируса КЧС с ферментом пероксидазой. Конъюгированный ферментом антиген вируса КЧС выявлял антитела как у крыс, так и у свиней, вакцинированных против КЧС.

В дальнейшем наряду с определением рабочего разведения (активности) антигена, меченного фермента, проводились испытания его специфичности при исследованиях сыворотки крови разных видов животных, полученных к разным возбудителям. Постановку ИФА проводили прямым ИФА, учет – инструментально, как описано выше.

Использование универсального диагностикума – меченого нами фермантом антигена, именуемого «Антигенный пероксидазный конъюгат» позволяло выявить антитела с высоким коэффициентом специфичности, достигающим 3,4 и 7,0, тогда как при исследовании гетерологичных антител к возбудителям бешенства, лихорадки Ку этот коэффициент не превышает 1,2.

Для сравнительной оценки ИФА в приведенной выше модификации с тремя другимивариантами метода были использованы прямой, непрямой «сэндвич» ИФА и модифицированный прямой «сэндвич» ИФА. Результаты исследований представлены в табл.1.

Таблица 1 - Результаты сравнительного испытания различных модификаций ИФА

Как видно из таблицы, все представленные и испытанные варианты ИФА позволяли выявлять прививочные антитела в сыворотке крови вакцинированных против КЧС животных. При этом отмечено, что изготовленный нами антигенный пероксидазный конъюгат обладает универсальностью, то есть с применением этого конъюгата можно выявлять антитела у всех видов вакцинированных животных, не прибегая к антивидовым сывороткам. При этом упрощается постановка реакции, сокращается стадийность и время анализа с 20 до 2 часов. Наряду с этим в сравнительных исследованиях меченый антиген оказался наиболее активным по сравнению с вторичными антителами в 2-4 раза, что позволило применять тест-систему прямого ИФА как перспективное средство иммунодиагностики.

Резюме

Использование конъюгата на основе метки антигена вируса КЧС с ферментом пероксидазы позволяет модифицировать и упростить технику прямого ИФА для быстрого скрининга эффективности вакцинации. При этом чувствительность метода повышается в 2-4 раза при сокращении времени анализа с 18 часов до 2-3 часов.

Усовершенствованный метод иммуноферментного анализа является высокоэффективной тест-системой для оценки вакцинопрофилактики КЧС.