Разработка биотехнологических подходов к созданию ферментированных напитков из пермеата с прогнозируемым углеводным составом

DOI:

Е. А. Абакумова, И. С. Родионов, Т. В. Нерсесян *Северо-Кавказский федеральный университет, г. Ставрополь, Россия; e-mail: , ORCID:

Шрамко М. И. и др. Разработка биотехнологических подходов к созданию ферментированных напитков из пермеата с прогнозируемым углеводным составом. Вестник МГТУ. 2025. Т. 28, № 4/2. С. 643–653. DOI:

e-mail: , ORCID:

Shramko, M. I. et al. 2025. Development of biotechnological approaches to creation of fermented permeate drinks with a predictable carbohydrate composition. Vestnik of MSTU, 28(4/2), pp. 643–653. (In Russ.) DOI:

В последние десятилетия вопросам создания высокотехнологичных производств в нашей стране уделяется повышенное внимание (Постановление Правительства РФ от 9 апреля 2010 г. № 218 "О мерах государственной поддержки развития кооперации российских образовательных организаций высшего образования, государственных научных учреждений и организаций реального сектора экономики в целях реализации комплексных проектов по созданию высокотехнологичных производств"¹). В современной молочной промышленности России существуют особенности создания высокотехнологичных производств, которые связаны, в первую очередь, с широким применением мембранной техники и технологий – микрофильтрации, ультрафильтрации, нанофильтрации, обратного осмоса ( Reig et al., 2021 ).

Следует отметить, что создание высокотехнологичного производства в молочной отрасли преимущественно направлено на получение целевого инновационного продукта и не всегда обеспечивает комплексность и завершенность полного технологического цикла переработки молочного сырья. Особенно это касается производства высокомаржинальных высокобелковых продуктов, например, свежих сыров типа Queso Fresco, творожных сыров, мягкого творога, молочно-белковых концентратов (МБК), концентратов мицеллярного казеина (КМК), концентратов сывороточных белков (КСБ), изолятов сывороточных белков (ИСБ), пептидов и др. ( Володин и др., 2022; Bogdanova et al., 2020 ). При организации таких высокотехнологичных производств с получением инновационных молочных продуктов и ингредиентов (сыра, творога, белков молока) образуются колоссальные объемы новых видов побочного молочного сырья – пермеатов мембранного разделения ( Мельникова и др., 2022 ). Динамика роста объемов производства пермеатов сладкой (подсырной) сыворотки в мире, которая фигурирует в международной статистике за последние 5 лет, составила около 19 % ( Мельникова и др., 2020 ). В пермеат переходит от 5,0 до 5,5 % сухих веществ молока, причем главенствующую роль играет лактоза, на которую приходится свыше 85 %, а также незначительное количество азотистых соединений – менее 0,17 %.

Анализ современных технических решений в молочной промышленности России показывает, что широкое внедрение мембранных методов на крупных и средних молокоперерабатывающих предприятиях приводит к получению аналогичных ультрафильтрационных пермеатов подсырной сыворотки (ПС) и обезжиренного молока (ОМ), а также творожной сыворотки (ТС), динамика роста которых значительно превышает зарубежную статистику, хотя по объемам занимает относительно меньший сегмент молочного рынка ( Мельникова и др., 2020 ). Следует отметить, что основной объем новых видов вторичного сырья приходится на пермеаты ПС и ОМ, получаемые методом ультрафильтрации при высокотехнологичном производстве КМБ и КСБ.

Исследование пермеатов ПС и ОМ ( Kravtsov et al., 2021; Lodygin et al., 2024 ) показало, что по своему составу они достаточно близки по содержанию сухих веществ – 4,94 ± 0,39 % и 4,94 ± 0,37 %, большая часть которых приходится на лактозу – 4,39 ± 0,43 % и 4,73 ± 0,26 %, по содержанию золы 0,40 ± 0,05 % и 0,44 ± 0,02 % и по содержанию общего азота от 0,19 до 0,25 %. Что касается свойств пермеатов ПС и ОМ, то они близки по показателям активной кислотности (рН) – 6,04 ± 0,29 и 6,72 ± 0,21, титруемой кислотности 10,0 ± 2,6 °Т и 10,6 ± 2,9 °Т и удельной электропроводности, значения которой идентичны 5,23 ± 0,34, мСм/см ( Kravtsov et al., 2021 ).

Учитывая состав пермеатов молочного сырья, зарубежные и отечественные производители используют ряд простых технологических решений с минимальными экономическими затратами. Это касается сухих продуктов – сухого пермеата и кристаллической лактозы ( Evdokimov et al., 2021; Halfwerk et al., 2023 ), на производство которых направляется более 60 % мировых объемов пермеата, сухих кормовых продуктов, концентратов и продуктов биотехнологического направления – производство спирта, биогаза, спортивных ( Drężek et al., 2021; Hattem et al., 2010 ), сквашенных, вино- и пивоподобных напитков ( Арсеньева и др., 2015 ), в том числе из сыворотки сухой и натуральной ( Антипова и др., 2023; Елисеева и др., 2023; Rodionov et al., 2023 ), с наполнителями и растительным сырьем ( Воронова и др., 2014; Мерзликина и др., 2019 ).

Известен ряд разработок, посвященных изучению гидролиза лактозы и белков во вторичном молочном сырье ( Поротова и др., 2015; Родионова и др., 2021; Рязанцева и др., 2022 ), а также исследования эффективности применения различных ферментов в кислой и сладкой молочной сыворотке ( Duan et al., 2022; Скворцов и др., 2014; Блиадзе и др., 2023 ). Изучение априорной информации в области применения пермеатов молочного сырья показало, что ниша производства освежающих, спортивных, ферментированных, низколактозных напитков с использованием биотехнологических подходов заполнена слабо и занимает незначительный сегмент рынка напитков. Поэтому создание биотехнологии ферментированных напитков из пермеата ПС является актуальной социально значимой задачей для расширения ассортимента продуктов функционального питания, в том числе для потребителей, страдающих непереносимостью лактозы.

Цель работы – разработка методологических принципов и биотехнологических подходов для производства ферментированных напитков на основе пермеата ПС с прогнозируемым углеводным составом.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования были выбраны подсырная молочная сыворотка; пермеат, полученный в результате обработки подсырной сыворотки методом ультрафильтрации; гидролизованный пермеат подсырной сыворотки.

Баромембранную обработку подсырной сыворотки осуществляли на пилотной ультрафильтрационной установке (типа UF-1 с полимерными мембранами). Ферментированный гидролиз лактозы в полученном пермеате проводили препаратом дрожжевой β-галактозидазы микробиального происхождения из штамма продуцента Kluyveromyces lactis "Лактозим 3000 LP-G" (Дания) с лактазной активностью 3000 лактазных единиц активности на мл. Для проведения гидролиза лактозы в пермеате ПС использовали стеклянный реактор (Minni-100-1), для ассимиляции остаточной лактозы в гидролизованном пермеате – симбиотическую закваску кефирных грибков (АО молочный комбинат "Ставропольский", г. Ставрополь).

Хроматограммы углеводного состава экспериментальных образцов гидролизованного пермеата получены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Thermo scientific Dionex ICS-5000+ (США) с колонкой Dionex Carbo PacTM PA 20 BioLCTM Analytical 3*150 mm. При изучении состава, органолептических и физико-химических свойств пермеатов применялись арбитражные и общепринятые в исследовательской практике методы:

– определение органолептических показателей по ГОСТ Р ИСО 22935-2;

– массовая доля сухих веществ – по ГОСТ Р 8.894-2015;

– массовая доля лактозы – по ГОСТ Р 54667-2011;

– активная кислотность (рН) – по ГОСТ 32892-20142.

Повторность проведения экспериментов – трехкратная. Обработка результатов исследований проводилась с использованием стандартного пакета программ хроматографа Thermo scientific Dionex ICS-5000+.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований получали пермеат ПС. Для этого подсырную сыворотку очищали от жира и частиц казеиновой пыли методом сепарирования, пастеризовали при температуре 75 ± 2 °C с выдержкой в течение 15–20 с, охлаждали до температуры 12 ± 2 °C и обрабатывали в ультрафильтрационной установке с использованием полимерных мембран с отсекаемой молекулярной массой белков 10–20 кДа. Ретентат (концентрат) направляли на производство КСБ, а пермеат ПС с содержанием сухих веществ 5,34 ± 0,40 %, в том числе лактозы 4,64 ± 0,32 %, с активной кислотностью рН 6,59 ± 0,16 использовали в дальнейших исследованиях при отработке биотехнологических режимов получения ферментированного напитка.

Динамику изменения углеводного состава пермеата ПС на всех стадиях биотехнологической обработки контролировали методом ВЭЖХ.

На рис. 1 представлена хроматограмма углеводного состава натурального пермеата ПС.

Представленная хроматограмма свидетельствует о том, что основным углеводом пермеата ПС является лактоза, профиль которой представлен в виде одного пика (99,15 %), а глюкоза и галактоза присутствуют в следовых количествах.

В настоящее время известно несколько способов технологической обработки сырья, которые способствуют удалению или трансформации лактозы: химический или ферментативный гидролиз, при котором происходит расщепление молекулы лактозы с присоединением воды и образованием глюкозы и галактозы; микробиологический метод сбраживания лактозы посредством молочнокислой микрофлоры до органических кислот и иных продуктов с использованием свободных или иммобилизованных клеток микроорганизмов; энзиматический метод, при котором используются свободные растворимые ферменты, находящиеся в жидкой среде или иммобилизованные на твердом носителе ( Добриян и др., 2019 ).

При проведении исследований использован ферментативный гидролиз лактозы, протекающий под действием фермента β-галактозидазы и получивший наибольшее распространение среди всех существующих методов. Исследования по эффективности гидролиза лактозы в пермеате ПС были провед ены с применением ферментного препарата β-галактозидазы микробиального происхождения из штамма продуцента Kluyveromyces lactis "Лактозим 3000 LP-G". Выбор ферментного препарата был обоснован в ходе предварительных исследований: оптимальный рН действия фермента (6,6–6,7), активность фермента 3 000 лактазных единиц активности на мл, температура исходного субстрата 38 ± 2 °C, что позволяло проводить обработку пермеата ПС в мягких режимах и достигать степени гидролиза 67–68 %. В дальнейшем это сущест венно сказывалось на формировании органолептических показателей напитка из пермеата ПС.

Рис. 1. Хроматогра м ма углевод н ого состава н атуральног о пермеата П С

F ig. 1. Chromatogram of t h e carbohydra t e compositio n of cheese w hey natural p e rmeate

На р и с. 2 представлена хрома т ограмма угл е водного со с тава гидрол и зованного п е рмеата ПС.

Рис. 2. Хроматограмм а углеводно г о состава ги д ролизованн о го пермеат а ПС

Fi g . 2. Chromatogram of the carbohydrate composition o f hydrolysed cheese whe y permeate

Хроматограмма (рис. 2 ) наглядно д е монстриру е т эффектив н ость выбра н ного процес с а гидролиза лакт о зы под воздействием фер м ента β-галак т озидазы, где отчетливо в и дны пики га л актозы (1) и г люкозы (2).

На следующем этапе ис с ледований б ы л выбран д р угой биотех н ологически й подход, кот о рый основан на пр и менении микробиологич е ского метод а обработки г и дролизованного пермеата ПС . Микроб и ологический мето д имеет ограничения, свя з анные со св о йствами ми к роорганизм о в и влияние м продуктов метаболизма на и х развитие и жизнеспособность. По м нению ряда исследователей ( Vieira et al., 2021 ) , этот метод мож е т быть более пригоден п ри произво д стве кислом о лочных на п итков из ча с тично гидр о лизованного лакт о зосодержащего сырья ф е рментом β-г а лактозидаз о й.

Для формирования гарм о ничного вку с а ферментир о ванного нап и тка нами бы л а выбрана си м биотическая заква с ка кефирных грибков с целью снижен ия количества лактозы в на п итке не толь к о в процессе сквашивания моло ч нокислых микрооргани з мов, но и в процессе со з ревания, ко г да происхо д ит ассимил я ция лактозы за сч е т жизнедеятельности ла к тозосбражи в ающих дро ж жей ( Hoffm a nn et al., 20 2 3; Евдокимов и др., 2024; Gao e t al., 2016 ).

На этапе сквашивани я микроорга н измы рода Lactobacill u s продуци р уют молоч н ую кислоту и по д авляют развитие посторон н ей микрофл о ры. На этап е созревания а ктивно разви в аются лакто з опозитивные дрож ж и – инициаторы спир т ового бро ж ения с обр а зованием э т анола и уг л екислого г а за, а также уксу с нокислые бактерии – пр о дуценты ук с усной кисл о ты ( Соколо в а и др., 202 4 ). Основны е метаболиты дрож ж ей и молочнокислых бактерий гриб к овой кефир н ой закваски – спирт и м о лочная кис л ота – наряду с др у гими специфическими антибактериа л ьными сое д инениями п р едотвраща ю т развитие посторонних микр о организмов, что увелич и вает функц и ональную з н ачимость и с роки годно с ти продукта.

Именно поэтому на сл е дующем те х нологическ о м этапе в г и дролизован н ый пермеат ПС вносили заква с ку кефирных грибков в к оличестве 0, 0 5 % от мас с ы ферменти р уемого субс т рата, продо л жительность сквашивания составляла 6–8 ч при темпер ат уре 26–28 ° С . После скв а шивания б ы л исследова н углеводный сост а в образцов пермеата ПС ( рис. 3).

Рис. 3. Хромат о грамма угле в одного сос т ава гидроли з ованного пе р меата ПС п о сле скваши в ания заквас к ой кефирны х грибков

Fig. 3. Chromatogram of the carbo h ydrate composition of hyd r olysed chees e whey perm e ate after fermen t ation by kefi r grain starter culture

После завершения процесса скваши в ания перме а та ПС образ ц ы герметич н о закрывал и и оставляли для созревания в течение 8 – 10 ч при т е мпературе 4 –6 °С. На рис. 4 пре д ставлена хр о матограмма угле в одного состава образца п ермеата ПС п осле созревания.

По окончанию процесса созревания в образце ферментированного напитк а на основе пермеата ПС, как видно на хроматограмме (рис. 4), прибор не зафиксировал наличие лак тозы. На хроматограмме углеводного состава отчетливо виден только пик глюкозы, помимо которой выявле ны еще два пика, однако эти вещества не были идентифицированы методом ВЭЖХ хроматографии как у глеводы.

Рис. 4. Хроматограмм а углеводно г о состава ги д ролизованн о го пермеат а ПС после сквашив а ния закваск о й кефирны х грибков и с о зревания

Fig. 4. Chromatogram of the carboh y drate compo s ition of hydrolysed chees e whey perme a te after ripe n ing

Анал и з экспериментальных д анных, пре д ставленных на хромато г раммах (р и с. 2–4), поз в оляет сделать сле д ующие выводы.

После процесса гидролиза наим е ньшее содер ж ание лактоз ы было выявлено в образц а х гидролизов а нного пермеата П С , полученных при дозе фермента 0,3 г/л, темпе р атуре 38 °С, продолжит е льности пр о цесса 120 мин, р Н 6,6–6,7. В процессе ск в ашивания и созревания в о всех обра з цах происх о дило посте п енное снижение лактозы за счет микрофлор ы кефирной з акваски (скв а шивание) и л актозосбра ж ивающих др о жжей (созревание ) .

Полу ч енный ферментирован н ый напито к на основ е пермеата П С оценив а ли по ком п лексу органолепт и ческих показателей – п о цвету, вку с у, запаху, мутности, од н ородности с труктуры, а также по некоторым специфическим свойст в ам ( Агарков и др., 2020 ), характеризу ю щим арома т и газообраз о вание (так называ е мая "естественная газац и я").

На за к лючительном этапе иссле д ований пров е дена сравни т ельная оценка органолепт и ческих пока з ателей исследуемы х образцов: натурального пермеата П С , гидролизованного пер м еата ПС и ф ерментиров а нного напитка на основе пермеата ПС (т а блица). По н ашему мне н ию, на фо р мирование о рганолепти ч еских показателей напитка влияли биотехно л огические п о дходы, которые использ о вались по вс е й технологи ч еской цепочке.

Во-п е рвых, на первой стадии ферментати в ного гидролиза пермеат а при испол ь з овании пре п арата дрожжевой β-галактозидазы микроб и ального пр о исхождения из штамма п родуцента K luyveromyce s lactis "Лактозим 3 000 LP-G" с лактазной ак т ивностью 3 0 00 лактазн ы х единиц активности на м л были искл ю чены реакции ме л аноидинообразования, в л ияющие на ц вет, вкус, за п ах и образо в ание хлопье в белка, вли я ющих на мутност ь и однородность жидкой структуры.

Во-в т орых, специфическую р о ль в форми р овании органолептическ и х показате л ей играет за к васка кефирных г р ибков с лактозосбражива ю щими дро ж жами, котор ы е совместн о с молочнок и слыми бакт е риями способству ю т накоплению в напитк е бактерицид н ых вещест в ( Yilmaz et a l ., 2022 ). Сле д ует отмети т ь, что дрожжи иг р ают ведущую роль в фо р мировании о рганолептического проф и ля напитка ( характерны й вкус, кислинка, присутствие ароматосбра ж ивающих б а ктерий и л е тучих кисл о т) из-за спо с обности др о жжей ассимилировать углеводные соедин е ния с обра з ованием сп и рта и углек и слого газа ( Rosa et al., 2017 ). По мнению р яда исследователей, что б ы получить л учший аромат у фермент и рованного н апитка, количество дрожжей д о лжно достигать, по кра й ней мере, 1 0 3–104 КОЕ / мл, что и н а блюдается п ри использ о вании производст в енных заквасок кефирно г о грибка ( G a o et al., 201 6 ; Соколова и др., 2024 ).

Таблица. Органолептическая оценка экспериментальных образцов натурального пермеата ПС, гидролизованного пермеата ПС и ферментированного напитка на его основе

Table. Organoleptic evaluation of experimental samples of natural permeate, hydrolysed permeate and fermented drink on its base

Органолептические показатели	Пермеат ПС натуральный	Пермеат ПС гидролизованный	Пермеат ПС ферментированный
Цвет	От светло-желтого до желтоватосоломенного, прозрачный	От желтовато-зеленого до желтого, прозрачный	Светло-желтый, со слабо-зеленоватым оттенком, прозрачный
Запах	Слабосывороточный	От слабо-сывороточного до кисломолочного	Чистый кисломолочный без посторонних запахов
Вкус	Кисломолочный, с легким сывороточным привкусом	Чистый кисломолочный, без посторонних привкусов, сладковатый	Кисломолочный, выраженный, с характерным дрожжевым привкусом и нотками остроты
Консистенция	Жидкая, однородная	Жидкая, однородная, слегка опалесцирующая	Жидкая, однородная с мелкими пузырьками естественной газации

В-третьих, эксперты, принимавшие участие в дегустационной оценке органолептических показателей напитка на основе пермеата ПС , отметили, что сродство ферментного препарата β-галактозидазы микробиального происхождения из штамма продуцента Kluyveromyces lactis , используемого на первой стадии ферментации, и кефирной закваски с лактозосбраживающими дрожжами рода Kluyveromyces , применяемой на второй стадии, вероятно, способствует проявлению синергизма при формировании гармоничного органолептического профиля разработанного напитка.

Таким образом, формирование органолептических показателей ферментированного напитка из пермеата ПС заключается в следующем: внешний вид – прозрачный напиток, цвет – светло-желтый, со слабозеленоватым оттенком, напиток обладает приятным кисломолочным вкусом и ароматом, сладковатый, с нотками остроты, консистенция жидкая, однородная с присутствием мелких пузырьков газа за счет естественной газации.

Заключение

Предложенные методологические принципы мембранного фракционирования подсырной сыворотки позволяют получать побочный продукт производства концентратов сывороточных белков – пермеат подсырной сыворотки, который является перспективным источником сырья для получения функциональных ферментированных напитков с прогнозируемым углеводным составом.

Применение биотехнологических подходов в виде последовательной обработки пермеата ПС ферментом β-галактозидазой и симбиотической закваской кефирных грибков дает возможность получать ферментированные напитки с содержанием лактозы не выше 0,1 %, что позволяет расширить ассортимент напитков и круг потребителей за счет людей с непереносимостью лактозы, а также уделяющих большое внимание здоровому питанию.

Конфликт интересов

Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда № 25-26-00264, URL: