Разработка и апробация дот-блот ИФА тест-cистемы для выявления антител к ВЛКРС

Для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресс тест-системы. Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа (1). При этом применяются различные технологии, среди которых немаловажную роль играют модифицированные методы ИФА, которые в представительном арсенале методов, используемых в вирусологии, занимают особое место. Несмотря на то, что его история насчитывает уже несколько десятилетий, интерес к данной проблеме не убывает (2). Согласно современной статистике (США и Европа) на долю ИФА приходится 60 % всех проводимых иммуноанализов (3). Дальнейшее развитие данной технологии направлено на расширение спектра анализируемых серологически значимых антигенов и лигандов, а также на разработку экспресс тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять наличие антител к данным антигенам в минимальном объеме без больших экономических затрат и за минимально короткий промежуток времени. В этой связи наиболее перспективными являются методы ИФА разной модификации в дот-блот варианте.

Дот-иммуноанализ основан на иммунохимической реакции антиген -антитело. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью антивидового конъюгата после добавления нерастворимого субстрата, образующего окрашенные (коричневые) пятна различной интенсивности в местах связывания антигена и антитела.

Материалы и методы. В работе использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ; положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА; иммуноферментный анализ ставили в непрямом варианте по методу, описанному Woller A. et al. (1976); использовали антиген, выделенный из крови больных лейкозом коров; набор для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом» производства ФКП «Курская биофабрика – фирма «БИОК».

Результаты исследований и обсуждение. Основой тест-системы является иммобилизованный на полоске нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) антиген ВЛКРС (4). Специфичность и чувствительность иммунохимических тест-систем всецело зависит от качества антигена. В своих прежних исследованиях нами установлено, что антиген ВЛКРС из набора для РИД исследований без дополнительной обработки не пригоден для дот-иммуноанализа. На полосках НЦМ проявлялись только едва заметные окрашенные пятна, по которым невозможно судить о характере иммунной реакции.

При выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы главным образом содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков. На разработанный способ подана заявка для патентования.

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров из различных хозяйств районов Республики Татарстан. По результатам исследований установили, что вирусные частицы выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51 применяемых в коммерческих наборах для ИФА.

Для постановки дот-иммуноанализа можно использовать различные твердофазные пористые носители. Носители на основе нитроцеллюлозы считаются наиболее удобными за счет высоких сорбционных свойств для белков (иммобилон) и простоты обращения с ними (5).

Полоски нитроцеллюлозной мембраны маркировали карандашом на квадратики 3х3мм для удобства при проведении реакции (один квадратик – одна реакция). Антиген адсорбировали путем погружения полосок НЦМ в раствор антигена в карбонатном буфере.

Для блокировки свободных после сорбции антигена мест на НЦМ использовали альбумин лиофилизированный (из человеческой сыворотки). Альбумин растворяли в дистиллированной воде и установили, что при использовании 0,5%-й концентрации отмечается полное отсутствие фона. Оптимальное время инкубации при комнатной температуре составило от двух часов и более. Полоски НЦМ промывали в твинфосфатном буфере, известном в методике классического ИФА как промывочный раствор, а также в дистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Иммобилоны как основа тест-системы готовы для дальнейшего использования. Процедура промывки иммобилонов описана многими исследователями (6), которые предлагают использовать дистиллированную воду, ЗФР

(забуференный физиологический раствор), Т-ФСБ и др. Результаты исследований показали, что промывка НЦМ дистиллированной водой не влияет чувствительность тест-системы. Однако на следующих стадиях иммуноанализа (после нанесения исследуемой сыворотки, конъюгата и субстрата) при промывании НЦМ необходимо использовать только специальные промывочные буферные растворы.

На следующем этапе нашей работы оптимизировали условия связывания антител с иммобилизованным на НЦМ антигеном, а также время инкубации НЦМ с конъюгатом и время ферментативной реакции с субстратом. При этом основной нашей задачей было определение минимального временного интервала инкубации во всех случаях, не вызывающего понижения чувствительности тест-системы.

В качестве конъюгата использовали антивидовые антитела меченые с пероксидазаой, субстрат – ТМБ. Таким образом, при разработке дот-блот тест-системы придерживались классических принципов твердофазной ИФА.

В качестве контрольных сывороток использовали положительные и отрицательные контроли коммерческого набора для выявления антител к ВЛКРС методом ИФА. Исследуемые сыворотки наносили в объеме 2 мкл. Нанесение раствора конъюгата и субстратной смеси проводили в двух вариантах: 1) точечный, 2) погружением иммобилона в предварительно подготовленные растворы реактивов (флотация). Объемы нанесения и время инкубации определялись экспериментально. Учет результатов производили визуально по наличию или отсутствию коричневых пятен на точках нанесения образцов (рис.1).

Рис.1 - Визуализация результатов дот-блот ИФА.

Тест-систему апробировали для выявления антител к ВЛКРС в пробах сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовали 22 пробы. В качестве сравнительного теста использовали ИФА в классическом исполнении с применением «набора для выявления антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом» производства ФКП «Курская биофабрика – фирма «БИОК». Одна проба служила отрицательным контролем. Все остальные – положительные в иммуноферментном анализе.

Результаты ИФА и дот-иммуноанализа в целом совпали, кроме 1-й пробы, которая в ИФА была положительной, а в дот-блот анализе -отрицательной.

Заключение. Проведенные исследования показали, что тест система дот-блот ИФА с использованием вирусных частиц выделенных из сыворотки крови больных лейкозом коров, вполне пригодна для скрининговых исследований на лейкоз крупного рогатого скота. Она обладает меньшей чувствительностью, чем ИФА, однако гораздо проще и дешевле при постановке, не требует специального оборудования. Постановка реакции требует гораздо меньшего времени по сравнению с классическим ИФА и не зависит от количества проб. Если для постановки классического ИФА требуется не менее 3-х часов, то для ИФА в дот-варианте около одного часа. Аналогичные заключения делают также ряд отечественных и зарубежных исследователей (7,8). При массовых исследованиях возможно нанесение раствора конъюгата и субстратной смеси методом флотации, что не влияет на         чувствительность метода.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Бреус Ю.В. Разработка и конструирование экспресс-теста для диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Ю.В. Бреус, О.Д.Небещук, Я.В.Хоменко и др. // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. – 2013. - №4 (79). – C. 15-21. 2. Иванов А.П. Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций /А.П.Иванов // Автореферат дисс. д.мед.н., Москва - 1998 г. 3. S, S Deshpande. Enzyme immunoassays—From concept to product development: Chapman & Hall, London., p.464. 1996 ISBN 0 ‐ 412 ‐ 0560101. 4. Владыко А.С. Разработка и апробация диагностической тест-системы для выявления антител к ВИЧ методом дот-иммуноанализа / А.С.Владыко, Т.В.Школина, Л.Е.Сурикова и др.// Рубрики:76.03.41, 76.35.33. Сроки выполнения НИР:1996-1998; 5. Таранин А.В. Способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок / А.В.Таранин, С.М.Мирошниченко, В.В. Перемыслов // Патент. № 2074393 от 27.02.1997; 6. Аронова Н.В. Использование препаратов липополисахарида Fracisella Tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе/ Н.В.Аронова, Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина и др.// Ростов-на-Дону. Патент 2362170 от 20.07.2009. 7. T. Anand, T.A. Narasa Raju, C. Vishnu, L.V. Venkateswar Rao, G. Sharma.Development of Dot-ELISA for the detection of human rotavirus antigen and comparison with RNA-PAGELett Appl Microbiol., 3 (2001), pp. 176–180. 8. Hemmatzadeh, F., F. Amini : Dot-blot enzyme immunoassay for the detection of bovine viral diarrhea virus antibodies. Vet. arhiv 79, 343-350, 2009.

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ДОТ-БЛОТ ИФА ТЕСТ-CИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВЛКРС

Джакаит Д.А, Якупов Т.Р.

Резюме

Разработана тест-система дот-блот ИФА с использованием вирусных частиц, выделенных из сыворотки крови больных лейкозом коров. Оптимизированы условия проведения и доказана возможность использования метода для диагностики лейкоза у крупного рогатого скота.

DEVELOPMENT AND TESTING OF THE DOT BLOT ELISA TEST-SYSTEM TO DETECT ANTIBODIES TO BLV

Jakait J.A, Yakupov T.R.