Разработка и безопасность применения животным новой формы стерически стабилизированого наноструктурного фосфорита

В последние годы в фармацевтической и комбикормовой промышленности внедряются и реализуются лекарственные формы и кормовые добавки, изготовленные на основе или с применением наночастиц высокой активности и наноструктурных материалов. Их увеличивающийся объем применения обусловлен специфическим механизмом адресной доставки, свободным преодолением биологических барьеров и высокой терапевтической эффективностью в живых организмах [1, 2, 5].

Одной из основных проблем остается нестабильность наночастиц и наноструктур новых препаратов и кормовых добавок, что существенно сокращает сроки хранения. Известно, что статическая стабилизация частиц и наноструктур природных минералов обеспечивает их устойчивое дезагрегированное состояние в течение месяца [3]. Имеются исследования по применению веществ, противодействующих агрегации, и длительно стабилизирующих структурное состояние новых материалов. Исследованиями авторов установлено, что полиакрилат натрия оказывает влияние на распределение частиц по размерам и длительно стабилизирует водную суспензию оксида титана [11]. В статье авторов показано, что применение полиакрилата натрия в качестве стабилизирующей добавки при ультразвуковом диспергировании способствовало уменьшению размера частиц природного минерала цеолита и увеличению периода стабилизированного состояния частиц цеолита до полугода [12]. Исследованиями других авторов показана эффективность диблок-диспергатора на основе полиакрилата аммония для стабилизации суспензий порошков с разными размерами частиц [10]. Канюлированный в рубец, двенадцатиперстную и подвздошную кишку бычков голштинской породы гель полиакрилата аммония (20 г полиакрилата аммония, 2 л водопроводной воды и 20 г глюкозы) однократно в сутки обеспечил увеличение общего переваривания питательных веществ в пищеварительном тракте. Полиакрилат аммония не повлиял на количество потребленных кормов и переваривание органических веществ, но усвояемость HDF (нейтрально детергентная клетчатка) незначительно снижалась [7].

Целью работы стало – разработка новой кормовой добавки – стерически стабилизированного наноструктурного фосфорита, и оценка его безопасности применения животным.

Материал и методы исследований .

Исследования проведены в отделе разработки био-, нанотехнологий в земледелии и животноводстве ФИЦ КазНЦ РАН – ОСП ТатНИИАХП. Использовали животных, полученных из вивария ФГБОУ

ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана». Объектами исследований стали белые крысы линии Вистар в возрасте четырех месяцев массой 200,8±12,2 г и их органы.

При проведении экспериментов по определению острой оральной токсичности руководствовались методическими указаниями [6, 8]. При подборе экспериментальных доз опирались на результаты ранее проведенных исследований острой оральной токсичности статически стабилизированного наноструктурного фосфорита со сроком хранения 33-35 суток [2, 9]. Учитывали этологию, клиникофизиологическое состояние животных, сохранность поголовья, кормовую и водную возбудимость.

Использовали стерически стабилизированный 0,1 % раствором полиакрилата аммония наноструктурный фосфорит, изготовленный методом ультразвукового диспергирования в приборе УЗУ-0,25 (Россия). Суспензию (фосфоритная мука + деионизированная вода + полиакрилат аммония) подвергали ультразвуковому диспергированию при частоте 18,5 кГц, выходной мощности прибора 80 ВТ, амплитуде колебания волновода – 5 мкм. Срок хранения изготовленного вещества составлял девять месяцев. Наноматериал изготавливали и аттестовывали в центре коллективного пользования «Наноматериалы и нанотехнологии» ФГБОУ Казанский национальный исследовательский технологический университет.

Результат исследований .

Определение безопасных доз применения стерически стабилизированного полиакрилатом аммония наноструктурного фосфорита изучали при однократном внутрижелудочном введении широкого диапазона доз наноструктурного фосфорита при помощи атравматического зонда. Предварительно животных в течение 12 часов содержали без корма, вода была без ограничений. Было сформировано восемь групп по 12 белых крыс. Крысы 1 группы были контрольными, которым вводили внутрижелудочно 3 см3 воды; крысам 2 опытной группы – 0,1 % раствор полиакрилата аммония (ПА) в количестве 3 см3; крысам 3 опытной группы – водную суспензию фосфоритной муки (Ф) тонкого помола в оптимальной дозе 0,1 г/кг массы тела; крысам 4 опытной группы – оптимальную дозу статически стабилизированного наноструктурного фосфорита (НФ) в дозе 0,02 г/кг массы тела; и крысам 5, 6, 7 и 8 опытных групп – стерически стабилизированный наноструктурный фосфорит (СтерНФ) в дозах 0,02; 0,04; 0,06 и 0,08 г/кг массы тела соответственно (Таблица 1).

Таблица 1  – Дозы и количество наноматериалов, сохранность поголовья при внутрижелудочном введении разных форм наноструктурного фосфорита

Контроль за клиникофизиологическим состоянием и поведением экспериментальных крыс проводили в течение 14 суток.

В первые 15-25 минут после внутрижелудочного введения веществ у крыс всех групп отмечали угнетенность, снижение активности и отсутствие водной и кормовой возбудимости, что, по нашему мнению, было обусловлено внутрижелудочным введением препаратов.

Исследование крыс через час после введения веществ, показало, что клиникофизиологическое состояния крыс 2, 3, 4 и 5 опытных групп идентично контрольным животным. Крысы этих групп проявляли интерес к воде и корму, реагировали на внешние раздражители, проявляли физиологическую активность. Животные 6 опытной группы в отличие от аналогов вышеперечисленных групп, отличались цианотичностью видимых слизистых, хвоста, морды, ушей и конечностей. Крысы 7 и 8 опытных групп характеризовались малой подвижностью, заторможенной реакцией на внешние раздражители, отсутствием водной и кормовой возбудимости. У этих крыс отмечали цианотичность видимых слизистых оболочек, хвоста, морды, ушей и конечностей.

Учет реакции через 4 часа после однократного внутрижелудочного введения веществ выявил, что клиникофизиологическое состояние крыс 2, 3, 4, 5 и 6 опытных групп подобно контрольным животным. Крысы проявляли физиологическую активность, быстро реагировали на внешние раздражители, проявляли интерес к воде и корму. Видимые слизистые оболочки, хвост, морда, ушные раковины и конечности опытных крыс имели характерные розовые оттенки и были сопоставимы с контрольными аналогами. У крыс 7 и 8 опытных групп наблюдали слабовыраженную водную и кормовую возбудимость, уши, морда, хвосты и видимые слизистые были белого цвета. Симптомы интоксикации характеризовались шаткостью походки, малой подвижностью, слабовыраженной реакцией на внешние раздражители, отмечали симптомы диспепсии у 1 и 2 особей, соответственно, 7 и 8 опытных групп. В 8 опытной группе в течение первых суток после внутрижелудочного введения стерически стабилизированного полиакрилатом аммония наноструктурного фосфорита выявляли гибель одной особи.

При вскрытии отмечали мелкоточечный диапедез слизистой желудочно-кишечного тракта. Капсулы паренхиматозных органов – печени и почек были напряжены, на разрезе несколько выбухали. Визуальных других изменений структуры, формы и цвета паренхиматозных органов не установлено.

При исследовании состояния крыс через 14 суток после внутрижелудочного введения веществ отмечали, что у всех животных была хорошо выраженная водная и кормовая возбудимость, крысы характеризовались активностью движений, быстрой реакцией на внешние раздражители, по клиникофизиологическому состоянию и поведению не отличались от крыс контрольной группы.

Заключение . При однократном внутрижелудочном введении исследуемых веществ установлены безопасные, токсичные и сублетальные дозы. Безопасными дозами стали: 0,1% водный раствор полиакрилата аммония (2); водная суспензия фосфоритной муки тонкого помола в дозе 0,1 г/кг (3); статически стабилизированный наноструктурный фосфорит в дозе 0,02 г/кг (4); и стерически стабилизированный наноструктурный фосфорит в дозе 0,02 г/кг массы тела (5), введение которых не оказывало отрицательного влияния на общее состояние и поведенческие реакции белых крыс, и было сопоставимо с крысами контрольных групп (1).

Установлены токсичные дозы: стерически стабилизированный наноструктурный фосфорит в дозе 0,04 (6) и 0,06 г/кг (7). Введение его в дозе 0,04 г/кг массы тела обусловило изменение клиникофизиологического состояния с проявлением цианотичности видимых слизистых, хвоста, конечностей и ушей, реакция на внешние раздражители, водная и кормовая возбудимость были сохранены. Введение его в дозе 0,06 г/кг обусловило изменение клинико-физиологического состояния с усугублением симптомов интоксикации и угнетением поведенческих реакций крыс. Установлена сублетальная доза: стерически стабилизированный наноструктурный фосфорит в дозе 0,08 г/кг (8). Введение его обусловило слабовыраженную реакцию на внешние раздражители, снижение подвижности, водной и кормовой возбудимости, диспепсию и летальность одной особи с преобладанием симптомов поражения органов желудочно-кишечного тракта.

Однократное внутрижелудочное введение стабилизатора в виде 0,1% полиакрилата аммония в состав наноструктурного фосфорита не оказало отрицательного влияния на организм крыс при применении безопасной дозы нановещества – 0,02 г/кг. Общее состояние крыс и поведенческие реакции были сопоставимы с контрольными аналогами и показателями крыс, получивших статически стабилизированный наноструктурный фосфорит в дозах 0,02 г/кг.

Резюме

Известно, что многие формы статически стабилизированных наноструктурных материалов обладают неустойчивостью структур, из-за чего имеют краткий период хранения. В статье представлен материал по разработке полиакрилата аммония в качестве стерического стабилизатора наноструктурного фосфорита, который обеспечивает устойчивость наноструктур в течение девяти месяцев хранения. Показаны результаты исследования острой оральной токсичности, определены безопасные, токсичные и сублетальная дозы. Дана оценка безопасности применения новой формы стерически стабилизированного наноструктурного фосфорита в сопоставлении с применением суспензии фосфоритной муки и статически стабилизированного наноструктурного фосфорита. Установлено, что стерически стабилизированный полиакрилатом аммония наноструктурный фосфорит в дозе 0,02 г/кг массы тела при однократном внутрижелудочном введении не оказывал влияния на функциональное состояние и поведение белых крыс.