Разработка иммуносорбента для получения хламидийных иммуноглобулинов

Зооантропонозные инфекции – это группа болезней, вызываемых бактериями, вирусами или грибами, присутствующие в различных популяциях животных и человека, которые способные передаваться от одного вида живых организмов другому. В процессе осуществления производственной или хозяйственной деятельности, а также в быту, контакты человека с животных, инфицированных этими возбудителями, несут потенциальную угрозы для заражения людей [6, 9]. Хламидиоз является одной из таких широко распространенных инфекций.

Обширный перечень клинических проявлений, острых форм течения инфекционного процесса, а главное, преимущественно латентное течение хламидийной инфекции затрудняет дифференцирование этого заболевания от других, основываясь только на результатах патологоанатомического вскрытия и симптомов у больных животных [3]. Для постановки конечного диагноза необходимо проведения комплекс лабораторных исследований [4, 5, 7].

Согласно "Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции животных", утвержденных зам. руководителя Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и Продовольствия Российской Федерации от 30 июня 1999 года № 13-7-2/643 диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет: хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале [2].

На сегодняшний день на рынке диагностических препаратов реализуются тест-системы для выявления генетического материала хламидий методом ПЦР и индикации хламидийных антигенов методом иммунной флюоресценции в патологических материалах. В тоже время для постановки этих реакций, в лаборатории, где они проводятся, должны быть оснащены специализированными помещениями,     оборудованием     и квалифицированными специалистами [8, 10].

Относительно    дешевыми    по себестоимости, менее трудозатратными и технологичными методами, внедренными в ветеринарную практику, позволяющими диагностировать хламидиоз, является выявление антигенов хламидий в патологическом материале методами ИФА и ИХА, для постановки которых необходимы очищенные специфические хламидийные иммуноглобулины [10].

Современные коммерциализированные и достаточно распространенные методы выделения высокоочищенных    иммуноглобулинов являются относительно дорогостоящими и требуют наличия    в    оснащении лабораторий        специализированного профессионального оборудования [10].

Однако, известны способы очистки сывороток крови от неспецифических компонентов и выделения иммуноглобулинов, специфичных к определенным антигенам различных микроорганизмов, путем их адсорбции на иммуносорбентах, производство и применение которых не требует дорогостоящего оборудования [1, 10].

В связи с этим, целью настоящей работы явилась разработка иммуносорбента, позволяющего упростить технологическую цепочку выделения высокоочищенных хламидийных иммуноглобулинов.

Материал и методы исследований. Работа выполнена на базе лаборатории вирусных заболеваний животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

В качестве носителя, для будущего иммуносорбента, использовали полимер – поликапролактон, который обладал следующими характеристиками: молекулярный вес – 63000-72000 г/моль; предел прочности –580 кг/см2, температура плавления – 59-60 °С, индекс текучести – 12-20 г/10 мин (при 160 °С, 2,16 кг), содержание воды – ≤ 1 %.

Для получения специфических гипериммунных хламидийных сывороток проводили иммунизацию овец эмульсионной вакциной на основе хламидийного антигена. Сыворотки получали стерильным методом, очистку осуществляли центрифугированием.

В качестве компонента, способного фиксировать на своей поверхности хламидийные антитела, использовали эфирный хламидийный антиген (патент R U2 485 972C 1 «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных»).

Активность каждой серии иммуносорбентов определяли в реакции иммуноферментного анализа по модифицированному методу. Реакцию ставили по следующей схеме. В две пробирки наливали по 1 см3 положительной гипериммунной сыворотки, реагирующей в ИФА в титрах от 1:3200 до 1:6400. В первую пробирку вносили 0,1 см3 твердого осадка, исследуемого иммуносорбента. Во вторую пробирку (контроль) вносили 0,1 см3 твердого осадка микрочастиц поликапролактона (несвязанных с антигеном), полученных на первом этапе. Далее две пробирки помещали в термостат и выдерживали при температуре плюс 37 °C в течение 1 ч. Иммуносорбент три раза отмывали от сыворотки, удаляли буферный раствор и ресуспендировали в 1 см3 рабочего разведения иммунопероксидазного коньюгата. Пробирки помещали в термостат на 40 мин. После инкубации иммуносорбент и микрочастицы 3 раза отмывали от коньюгата и удаляли буфер. Далее в пробирки вносили субстрат-индикаторный раствор. После окрашивания раствора в желтый цвет реакцию останавливали, иммуносорбент осаждали на центрифуге, из каждой пробирки брали по 0,15 см3 надосадка и вносили их в лунки полистирольного планшета. Учет результатов проводили на регистрирующем устройстве [10].

Пробу считали положительной, если частное показателя оптического преломления опытного образца по отношению к показателю оптического преломления контроля была равна или больше 1,2.

Оценку результатов ИФА осуществляли на планшетном фотометре фирмы BioRad Model 680.

Результат исследований. Первым этапом изготовления иммуносорбента явилось получение микрочастиц поликапролактона диаметром 02-0,3 мм. С этой целью гранулы поликапролактона диаметром 3 мм помещали в хлороформ в научно обоснованных пропорциях для полного их растворения. Далее в полученный раствор вносили 600 см³ этанола, после изменения цвета полученной дисперсной системы её помещали в холодильную камеру и выдерживали в течение 24 ч при температуре плюс 4 °С. В течение этого времени микрочастицы поликапролактона выпадали в осадок. Отмывку микрочастиц от этанола и хлороформа осуществляли путем центрифугирования при скорости

• 1,5 тыс об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, полученный осадок ресуспендировали дистиллированной водой.

Так как, сам по себе, хламидийный антиген не способен фиксироваться на поверхности полимерного носителя (микрочастицы поликапролактона), сшивку этих компонентов осуществляли через линкер. Линкер представлял из себя молекулу 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина. Для фиксации линкера на поверхности полимерного носителя твердый осадок микрочастиц поликапролактона помещали в 10 % раствор 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина и выдерживали при температуре плюс 37 °С (реакция аминолиза). Для определения лучшей экспозиции, обработки полимерного носителя диамином, повышающей специфическую емкость иммуносорбента за счет наличия наибольшего количества линкерных групп на поверхности микрочастиц, проводили три серии постановки реакции аминолиза с временными промежутками контакта полимера с диамином равных 15 мин, 30 мин и 45 мин.

После завершения реакции аминолиза микрочастицы, активированные линкерной группой, отмывали от раствора диамина и помещали в 2 % раствор глутарового альдегида на 3 ч при температуре плюс 24 °С. Далее после отмывки полимерного носителя от несвязавшегося глутарового альдегида его помещали в раствор хламидийного антигена (разведение 1:5 в 0,6 молярном карбонатно-бикарбонатном буфере с pH 9,6) на 12 ч при температуре 4 °С. Несвязавшийся антиген удаляли путем центрифугирования, удаления супернатанта и ресуспендированием иммуносорбента 0,01 молярным фосфатнобуферным раствором (процедуру повторяли три раза).

Специфическую емкость (активность) иммуносорбентов полученных при разных экспозициях постановки реакции аминолиза определяли в ИФА. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Активность иммуносорбента в ИФА

Как видно из таблицы 1, во всех случаях коэффициент специфичности (К. сп.) был выше значения 1,2. Минимальное его значение (3,2) было выявлено при изучении серий иммуносорбентов полученных при экспозиции обработки поликапролактона диамином в течение 15 мин. Средний показатель (5,8) был зафиксирован при оценки специфической емкости серий иммуносорбента, реакцию аминолиза проводили в течение 45 мин. Самый высокий показатель специфической емкости был выявлен у серий иммуносорбента, полученный при проведении реакции аминолиза в течение 30 мин.

Заключение. Таким образом, разработанный способ получения иммуносорбента, на основе поликапролактона и хламидийного антигена, обеспечивает его способность фиксировать на своей поверхности специфические хламидийные иммуноглобулины из иммунных сывороток крови животных. Способ отличается простотой и воспроизводимостью.