Разработка компьютерной программы автоматического распознавания хромосом свиньи

Актуальность применения компьютерных анализаторов изображения в современных цитогенетических исследованиях совершенно очевидна. К сожалению, в селекционной и ветеринарной практике подобные методы практически не применяют из-за отсутствия программ автоматического распознавания хромосом сельскохозяйственных животных. Необходимость цитогенетического контроля в свиноводстве обусловлена многочисленными случаями обнаружения хряков-производителей с реципрокными транслокациями: в разных странах зарегистрировано уже 45 хряков — носителей реципрокных транслокаций. Все хряки, у которых были выявлены реципрокные транслокации, характеризовались нормальной половой активностью и спермопродукцией, но у спаренных с ними свиноматок наблюдалось значительное снижение размера помета (от 23 % до полной стерильности) за счет гибели эмбрионов с несбалансированным кариотипом (1). В специальных исследованиях, проведенных во Франции, показано, что снижение прибыли от использования одного хряка с реципрокной транслокацией на ферме с 32 свиноматками за год составляет 48-52 % (2). Выявление транслоцированных хромосом возможно только на GTG-окрашенных хромосомах свиньи. Экономические потери от использования хряков с реципрокными транслокациями в качестве племенных животных во много раз превосходят затраты на проведение их цитогенетического обследования (3).

В связи с этим в задачу нашей работы входила разработка оригинальной компьютерной программы автоматического распознавания дифференциально окрашенных хромосом свиньи для цитогенетического контроля племенных хряков.

Описание методики . Материалом для исследования служила культура лимфоцитов периферической крови четырех хряков породы бельгийский ландрас. Культивирование лимфоцитов периферической крови осуществляли по общепринятой методике, препараты метафазных хромосом получали по стандартному протоколу (4). Для дифференциального окрашивания хромосом свиньи использовали один из вариантов GTG-метода (5). Препараты оценивали на компьютерном анализаторе изображений, состоящем из микроскопа (Axioskop 2), черно-белой CCD-камеры высокого разрешения (VT-13X, 1300½1030 пикселей), компьютера (Pentium IV-2000, 256Mb RAM 40 Gb HDD, монитор 17", Windows XP) и оригинального компьютерного обеспечения «Видео ТесТ-Карио 3.1», разработанного для ввода, сохранения, обработки, анализа и автоматической классификации хромосом (ООО «ВидеоТесТ», C.-Петербург).

Черно-белые цифровые системы ввода, используемые в наших исследованиях, обладают повышенной разрешающей способностью при оцифровке яркости; размер пикселя составлял 6,7½6,7 мкм. Автоматическое распознавание хромосом осуществляли с помощью классификатора на основе набора специфичных для каждой хромосомы параметров, таких как центромерный индекс, длина центральной линии, число и взаимное расположение на хромосоме разных по интенсивности окрашива-114

ния дисков. Точность работы классификатора зависит от объема внесенной в него информации. Программа «Видео ТесТ-Карио 3.1» позволяет дополнять классификатор хромосом изучаемого объекта в случае необходимости. В процессе распознавания (классификации) хромосомы метафазной пластинки проходят три последовательных этапа анализа. На первом этапе — «Метафаза» — предусмотрено изменение яркости/контраста, усиление резкости изображения, удаление чужеродных элементов, попавших в метафазную пластинку (интерфазные ядра, хромосомы близлежащих метафаз и т.д.), и дополнение метафазной пластинки, если хромосомы попали в разные поля зрения. На следующем этапе — «Анализ» — подбирают режим выделения хромосом, который обычно сохраняется при оценке последующих метафазных пластинок на том же препарате. Затем производят следующие операции: нанесение контуров хромосом, разделение и корректировку разделения хромосом в случае их соприкосновения или наложения, нанесение и корректировку центральных линий хромосом и центромер. На этапе «Анализ» осуществляют автоматический подсчет числа хромосом на метафазной пластинке. Заключительный этап анализа — «Карио-грамма» — включает автоматическое распознавание и расстановку хромосом (построение кариограммы), согласно принятой для конкретного объекта номенклатуре хромосом. Здесь же можно осуществлять перенос, поворот, зеркальное отображение и выпрямление хромосом, а также отображать рядом с хромосомой ее идиограмму соответствующего уровня разрешения. Для свиньи общепринятыми являются идио-граммы на уровне разрешения 287 или 539 дисков (6, 7).

В нашей работе для создания базы данных были вручную введены 1578 GTG-окрашенных хромосом разной степени конденсации из 47 метафазных пластинок с хорошим расположением хромосом (без наложений) и построены кариограммы, согласно общепринятой номенклатуре (8).

Пример получаемого изображения метафазной пластинки на этапе анализа кариограммы представлен на рисунке. Для того чтобы проверить правильность автоматического распознавания хромосом свиньи созданным нами классификатором, в автоматическом режиме было проанализировано 16 метафаз, подобранных случайным образом из другой выборки метафазных пластинок. В среднем число ошибочно распознанных хромосом было равно 3,12 ± 0,26 шт. на одну метафазную пластинку; частота ошибки при этом составляла 8,2 %.

Основными причинами ошибок при автоматическом распознавании хромосом свиньи могут быть следующие: неверное построение центральной линии на изогнутых и соприкасающихся хромосомах, неправильное распознавание центромер акроцентрических хромосом из-за их очень слабого прокрашивания, а также сходство по расположению и рисунку дисков на хромосомах 9 и 10, что чрезвычайно затрудняет иденти

а

б

Кариограммы хромосом свиноматки в норме (а) и хромосом хряка с реципрокной транслокацией — rsp (1p-; 11p+) (б) , полученные на основе использования разработанного автоматического классификатора.

фикацию последних (9). Полученные нами значения ошибок, возникающих в процессе автоматического распознавания хромосом свиньи, находятся в допустимых пределах при исследованиях подобного рода. Для сравнения ошибки при автоматическом распознавании хромосом человека составляют 4-5 шт. на одну метафазу (8-9 %) (10, 11). Показано, что частота ошибок при распознавании хромосом напрямую зависит от базы данных классификатора и может варьировать от 9,2 % (анализировали хромосомы без наложений) до 47,4 % (в классификатор входили хромосомы с наложениями) (12). При автоматическом распознавании хромосом 1, 6, 11, 13, 15 и Y ошибки отсутствовали, при оценке хромосомы 8 частота ошибочного распознавания составляла 20 %; аналогичные данные для хромосом человека варьируют от 1,4 до 17,2 % (10).

Необходимо иметь в виду, что используемые программы автоматического распознавания хромосом, в том числе и «Видео ТесТ-Карио 3.1», позволяют опера-116

тору вручную откорректировать ошибки в процессе кариотипирования и, следовательно, избежать ошибок на этапе построения кариограммы. Для проверки и оценки работы созданного классификатора мы использовали также препараты хромосом хряка с реципрокной транслокацией rcp (1p-;11p+), описанного нами ранее (13). При дифференциальном окрашивании хромосом этого хряка было показано, что разрывы произошли в центральной части короткого плеча одного из гомологов хромосомы 1 и в районе теломеры короткого плеча одного из гомологов хромосомы 11. У свиноматок, спаренных с этим хряком, зарегистрировано уменьшение размера помета на 22,6 % по сравнению со средними показателями остальных хряков с этой же станции искусственного осеменения (г. Ямбол, Болгария). Гомологи хромосом 1 и 11, как вовлеченные, так и не вовлеченные в реципрокную транслокацию, были классифицированы правильно (см. рис., б).

Таким образом, представленная нами оригинальная компьютерная программа автоматического распознавания хромосом свиньи может найти широкое применение в работах по цитогенетическому контролю хряков-производителей, а также идентификации хромосом в перевиваемых клеточных линиях свиньи, используемых в медицинских исследованиях.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    С т е ф а н о в а В.Н. Спонтанные транслокации у свиней на современном этапе исследований. В сб.: Цитогенетика и молекулярная генетика сельскохозяйственных животных. Л., 1987: 36-50.

• 2.    P o p e s c u C.P., B o s c h e r J., Z h a n g S. Cytogenetic evaluation of boar with a low prolificacy: two new types of chromosome translocation. Ann. Genet., 1988, 31: 75-80.

• 3.    G u s t a v s s o n I. Chromosome aberration and their influence on the reproduction performance of domestic animals. Z. Tierzuchtg. Zuchtsbiol., 1980, 97: 176-195.

• 4.   M o o r c h e a d P., N o w e l l P., M e l l m a n W.J. e.a. Chromosome preparations of leucocytes cul

  tured from human peripheral blood. Exp. Cell Res., 1960, 20: 613-616.

• 5.   O z k i n a y C., M i t e l m a n F. A simple trypsin-Giemsa technique producing simultaneous G- and C-

  banding in human chromosomes. Hereditas, 1979, 90: 1-4.

• 6.   G u s t a v s s o n I. Standard karyotype of the domestic pig. Hereditas, 1988, 109: 151-157.

• 7.   Y e r l e M., G a l m a n O., E c h a r d G. The high- resolution GTG-banding pattern of pig chromosomes.

• 8.   F o r d C.T., P o l l o c k D.L., G u s t a v s s o n I. Proceeding of the first international conference for the

  standardization of banded karyotypes of domestic animals. Hereditas, 1980, 92: 145-162.

• 9.   H a n s e n K.M. Identification of the X chromosome of the domestic pig. Hereditas, 1980, 12: 225-232.

• 10.  L u n d s t e e n C., G e r d e s T., M a a h r J. Automatic classification of chromosomes as part of a rou

  tine system for clinical analysis. Cytometry, 1986, 7: 1-7.

• 11.    P i p e r J., G r a n u m E. On fully automatic feature measurement for banded chromosome classification. Cytometry, 1989, 10: 242-256.

• 12.    G r a h a m C.C., G r a h a m J. Trainable grey-level models for disentangling overlapping chromosomes. Pattern Recognition, 1999, 32: 1335-1349.

• 13.    S t e f a n o v a V.N., T s o c h e v a K.T. A reciprocal translocation rcp (1p-; 11p+) in a boar produced a decreased litter size. Abstr. of 9^th European Colloquium on Cytogenetics of Domestic Animals. Toulose-Auzeville, 1999: 42.

Cytogenet. Cell Genet., 1991, 56: 45-47.

ГНУ Всероссийский НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных, 196625,