Разработка молекулярно-генетического метода для выявления фальсификации гранатового сока

Введение. Гранатовый сок пользуется большим спросом из-за своих полезных свойств. Исследования гранатового сока показали его высокие антиоксидантные свойства по сравнению с такими соками, как виноградный, апельсиновый или яблочный, и доказали положительное влияние на здоровье человека [1]. Высокая себестоимость гранатового сока по сравнению с соками винограда и яблока подталкивает недобросовестных производителей к его фальсифицированию. В связи с высоким спросом и ограниченными запасами сырья производитель прибегает к разбавлению сока с целью поддержания объемов производства. Фальсификация гранатового сока связана с замещением фруктового компонента и проводится путем добавления яблочного или виноградного сока [2].

Наиболее распространенным и эффективным методом обнаружения присутствия в гранатовом соке яблочного является исследование содержания яблочной кислоты. Помимо яблочного распространено добавление в него сока из красных сортов винограда, в качестве подсластителя и красящего вещества, идентичного природному цвету спелого граната. В обоих случаях исследования проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой (или ионнообменным методом) с УФ-детектированием или детектированием на масс-спектрометре [3, 4]. Выявление внесения виноградного сока возможно также при помощи анализа аминокислот. В качестве маркера в данном методе выступает аминокислота пролин – нетипичная для плодов граната [5].

При всех достоинствах система ВЭЖХ имеет высокую стоимость, требует высоко квалифицированного персонала, тщательной пробопод-готовки, наличие большого количества стандартных и калибровочных образцов. При этом количественная оценка не всегда может дать однозначный результат присутствия фальсификации соков, если объем замещения фруктового компонента не превышает 5 %. В свою очередь, современные возможности молекулярногенетического анализа позволяют выявлять присутствие посторонних соков благодаря высокой чувствительности.

Цель исследования: разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК винограда и яблока в составе гранатового сока и в дальнейшем системы молекулярногенетического контроля происхождения соковой продукции. Кроме этого, предполагается значительно снизить себестоимость анализов.

Для решения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи :

• 1)    подобрать видоспецифичные олигонук-леотидные праймеры;

• 2)    подобрать и оптимизировать условия амплификации;

• 3)    провести оценку метода путем испытаний подготовленных для исследования соков.

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали соки, полученные из зрелых плодов граната, яблока и винограда, смешивая их в различных пропорциях: сок гранатовый – 100 %; сок яблочный 100 %, сок виноградный – 100 %; сок гранатовый – 95 % плюс сок яблочный – 5 %; сок гранатовый – 95 % плюс сок виноградный – 5 %. Полученные образцы соков подвергали термической обработке при температуре 118 °С в течение 5 мин. Выделение ДНК проводили методом осаждения на сорбенте при помощи коммерческого набора «Универсальная пробоподготовка» (ООО «Лаборатория Изоген» Россия, Москва). Объем пробы для выделения ДНК составлял 150 мкл.

Анализ геномов проводили, используя базу данных NCBI – National Center for Biotechnology Information (Национальный центр биотехнологический информации) и программы BLAST – Basic Local Alignment Search Tool. Синтез праймеров осуществлялся ООО «Компания “Син-тол”» (Россия, Москва).

Реакционную смесь для проведения ПЦР готовили с использованием набора реагентов «GenPak PCR Core» (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва). Амплификацию проводили при помощи программируемого амплифи-катора «ТерцикТМ» (ООО «ДНК-Технология», Россия, Москва).

Разделение продуктов амплификации проводили электрофоретически в 2 % агарозном геле (ООО «Компания Хеликон», Россия, Москва) в ТВЕ-буфере (Fermentas, США) с добавлением бромистого этидия (ООО «Лаборатория Изоген», Россия, Москва). Ампликоны визуализировали при помощи трансиллюминатора УВТ-1 (ООО «Биоком», Россия, Москва) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 360 нм и фотографировали.

Результаты исследования и их обсуждение. При разработке метода идентификации яблочного сока использовали олигонуклеотид-ные праймеры Mal_f и Mal_r, Mal_for и Mal_rew, подобранные нами путем изучения генома яблони домашней ( Malus domestica ). Нуклеотидные последовательности праймеров приведены в таблице 1.

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров для идентификации ДНК Malus domestica

Праймер	Нуклеотидная последовательность
Mal_f	TCT-TAC-CGA-ATA-GGT-CCA-AAA-C
Mal_r	GGC-TCT-ACC-CAT-TTA-TTC-ACT-C
Mal_for	GTA-CCG-TAA-GGT-TCA-ATA-GAT-G
Mal_rew	CAG-GTT-ACA-GTA-AAT-CCG-ATA-C

Разработку и оптимизацию условий реакции проводили с использованием ДНК, извлеченной из мякоти плода яблони. Параметры амплификации, общие для обеих пар праймеров, приведены в таблице 2, результаты представлены на рисунке 1.

Для разработки метода идентификации сока винограда мы использовали праймеры V1 и V2, Vv_f и Vv_r, подобранные нами путем изучения генома винограда культурного ( Vitis vinifera ). Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в таблице 3.

Таблица 2

Показатель	Md1	Md2	Md3
Перв. денатур.	94 °С – 4 мин	94 °С – 4 мин	94 °С – 4 мин
Амплификация (35 циклов): денатурация	94 °С – 30сек	94 °С – 30сек	94 °С – 30сек
отжиг праймеров	64 °С – 30 сек	60 °С – 30 сек	56 °С – 30 сек
элонгация	72 °С – 1 мин	72 °С – 1 мин	72 °С – 1 мин
Заключительная элонгация	72 °С – 5 мин	72 °С – 5 мин	72 °С – 5 мин

Таблица 3

Нуклеотидные последовательности праймеров для идентификации ДНК Vitis vinifera

Праймер	Нуклеотидная последовательность
V1	AAC-TCG-ATA-AAG-GAT-GAA-GGA-TAA
V2	CTG-AGA-CGG-ACA-CTA-TTT-CAC-AC
Vv_f	TTG-GAT-CCA-TCA-CTC-TTG-TTT-C
Vv_r	TTG-GTT-GAG-GGA-AAA-AGG-AAA-G

Параметры амплификации праймеров Mal_f и Mal_r, Mal_for и Mal_rew

Подбор и оптимизацию условий реакции проводили с использованием образцов ДНК, извлеченных из соков, полученных из зрелых плодов винограда белого и красного сортов.

Параметры амплификации, общие для обеих пар праймеров, приведены в таблице 4, результаты амплификации представлены на рисунках 2 и 3.

Рис. 1. Результаты амплификации с использованием праймеров

Mal_f и Mal_r, Mal_for и Mal_rew: Md1, Md2, Md3 – программы амплификации; 1 – праймеры Mal_f и Mal_r; 2 – праймеры Mal_for и Mal_rew; (К) – отрицательный контроль реакции

Подобранные условия позволяют идентифицировать ДНК яблока с использованием праймеров Mal_f и Mal_r. Результат реакции с использованием пары праймеров Mal_for и

Mal_rew оказался отрицательным. В дальнейших исследованиях мы применяли праймеры Mal_f и Mal_r и проводили амплификацию по программе Md2.

Параметры амплификации праймеров V1 и V2, Vv_f и Vv_r

Таблица 4

Показатель	V1	V2	V3
Первичная денатурация	95 °С – 4 мин	95 °С – 4 мин	95 °С – 4 мин
Амплификация (35 циклов): денатурация	94 °С – 30 с	94 °С – 30 с	94 °С – 30 с
отжиг праймеров	64 °С – 45 с	60 °С – 45 с	56 °С – 45 с
элонгация	72 °С – 45 с	72 °С – 45 с	72 °С – 45 с
Заключительная элонгация	72 °С – 5 мин	72 °С – 5 мин	72 °С – 5 мин

Рис. 2. Амплификация с применением праймеров Vv_f и Vv_r:

V1, V2, V3 – наименования программ; (K-) – отрицательный контроль реакции; Вк – виноград красный, Вб – виноград белый

Пара праймеров V1 и V2 не вступили в реакцию с ДНК-матрицей и не образовали фрагментов; в то же время праймеры Vv_f и Vv_r оказались комплементарны ДНК как красного, так и белого винограда. Наилучшая визуализация ампликонов достигается при применении программы V1.

Используя подобранные и оптимизированные условия реакции, провели оценку возможности выявления фальсификации гранатового сока. Результаты амплификации представлены на рисунках 3 и 4.

Рис. 3. Выявление добавления яблочного сока (5 % от общего объема):

1 - отрицательный контроль; 2 - сок гранатовый 100 %; 3 - сок яблочный 100 %; 4 - сок гранатовый 95 %; сок яблочный - 5 %; 5 - сок виноградный 100 %

Рис. 4. Выявление добавления виноградного сока (5 % от общего объема):

1 - отрицательный контроль; 2 - сок гранатовый 100 %; 3 - сок виноградный 100 %; 4 - сок гранатовый 95 %; сок виноградный - 5 %; 5 - сок яблочный 100 %

Качественная реакция на присутствие ДНК яблока дала положительный результат только в пробах, содержащих яблочный сок. В образце, содержащем 100 % сока граната, продукты реакции не образуются. Качественная реакция на присутствие ДНК винограда также дала положи- тельный результат только в пробах, содержащих виноградный сок. Таким образом, применение ПЦР с использованием подобранных праймеров и программ амплификации позволяет выявлять замену доли гранатового сока яблочным или виноградным в объеме до 5 %.

Выводы

• 1.    Доказана возможность применения ПЦР с целью выявления фальсификации гранатового сока, связанной с его разбавлением яблочным или виноградным соками.

• 2.    Нижний предел обнаружения искомого компонента составляет до 5 % от общего объема образца.

• 3.    Путем анализа генных карт были выбраны и синтезированы видоспецифичные праймеры для Vitisvinifera и Malusdomestica .

• 4.    Подобраны и оптимизированы условия амплификации.