Разработка мультиштаммовой пробиотической закваски

В современных условиях в связи с ухудшением экологической обстановки и широким применением антибиотиков наблюдается ухудшение здоровья населения.

В настоящее время проблема изучения микробной экологии человека выдвигается в разряд наиболее актуальных и перспективных. Разработка и массовое использование пробиотиков и пробиотических продуктов являются микроэкологическим базовым приемом поддержания физического и духовного здоровья населения, увеличения продолжительности и активности жизни пожилых людей и важнейшей предпосылкой появления нового здорового поколения.

В связи с этим перед молочной промышленностью стоит перспективная научнотехническая проблема – совершенствование и выход на новый качественный уровень по производству и использованию микроорганизмов-пробиотиков.

В этом отношении заслуживают внимания микробные консорциумы, ярким представителем которых являются кефирные грибки. Являясь комбинацией разных микроорганизмов, микробные консорциумы менее чувствительны к воздействию фагов, ингибиторов роста и других вредных для микроорганизмов факторов. Отмечается, что для биоинженерии и индустриальной биотехнологии микробные консорциумы становятся той «горячей точкой» роста, которая будет со временем определять темпы их дальнейшего развития [1].

В последние годы все большее внимание исследователей привлекают пропионовокислые бактерии, обладающие высокими пробиотическими свойствами. Положительная роль пропионовокислых бактерий обусловлена образованием ими пропионовой кислоты, минорных органических кислот, ферментов и большого количества витамина В 12 [2].

Сочетание микрофлоры кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий позволит повысить пробиотические свойства продуктов. По мнению многих исследователей, многоштаммовые закваски устойчивы к неблагоприятным факторам среды и обладают более высокой активностью в сравнении с заквасками, приготовленными на отдельных культурах.

Целью настоящего исследования является создание консорциума микроорганизмов с новыми биотехнологическими свойствами.

Объекты и методы исследований

Объектами исследований служили штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacte-rium freudenreichii subsp. shermanii КМ 186 , Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii АС-2500, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503 , полученные из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированные биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государственном технологическом университете (ныне ВосточноСибирский государственный университет технологий и управления). Культивирование пропионовокислых бактерий осуществляли на сывороточной среде с добавлением ростовых факторов [2].

Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса [3], содержание витамина В12 - спектрофотометрическим методом [4].

Результаты и их обсуждение

Многочисленными исследованиями доказано, что при подборе заквасок для кисломолочных продуктов очень важно, чтобы входящие в состав микроорганизмы находились в прочных симбиотических взаимоотношениях. Поэтому первостепенной задачей при составлении заквасок является выявление взаимоотношений между микроорганизмами. Известно, что молочнокислые бактерии находятся в антагонистических и симбиотических взаимоотношениях. При антагонизме наблюдается угнетение роста, т.е. культуры - антагонисты не способны сочетаться с культурами другого вида, а симбиотический характер взаимоотношений ведет к взаимному усилению роста.

С учетом вышесказанного исследуемые культуры были проверены на антагонизм по методике Романович.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Исследование взаимоотношений между микроорганизмами

Вид микроорганизма	Фильтрат чистой культуры
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii КМ 186	Реакция отрицательная
Propionibacterium freudenreichii subsp. freuden-reichii АС-2500	Реакция отрицательная
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503	Реакция отрицательная
Кефирная грибковая закваска	Реакция отрицательная

Следует отметить, что изменение окраски метиленовой сини в присутствие пропионовокислых бактерий, а также в сочетании пропионовокислых бактерий с кефирной грибковой закваской не происходило в течение 2 - 3 ч. А через 4 - 4,5 ч начиналось постепенное обесцвечивание метиленовой сини одновременно с контролем (без пропионовокислых бактерий). Полное обесцвечивание наступало через 8 - 10 ч, что свидетельствует об отсутствии явления антагонизма. Следовательно, исследуемые культуры могут быть рекомендованы для составления комбинированной закваски.

Для более детального выяснения характера взаимоотношений между микроорганизмами исследовали влияние пропионовокислых бактерий на развитие микрофлоры кефирной закваски. Результаты представлены в таблице 2 (для исследований был взят штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii КМ 186).

Анализ данных, представленных в таблице 2, показывает, что пропионовокислые бактерии стимулируют рост микроорганизмов кефирной грибковой закваски. В процессе роста пропионовокислые бактерии обогащают среду рядом продуктов своего метаболизма, особенно витаминами группы В. Микроорганизмы кефирной грибковой закваски используют для своего развития данные факторы роста.

Исследование влияния фильтратов культуральной жидкости на рост пропионовокислых бактерий

Фильтраты культуральной жидкости	Рост Pr. Shermanii в разведениях
	1:4	1:8	1:16
Кефирная грибковая закваска	+ + +	+ + + +	+ + + +
Pr. shermanii КМ186 и кефирная грибковая закваска 1:1	+ + +	+ + + +	+ + + +
Pr. shermanii КМ 186 и кефирная грибковая закваска 1:0,8	+ + + +	+ + + +	+ + + +
Pr. shermanii КМ 186 и кефирная грибковая закваска 1:0,5	+ + +	+ + + +	+ + + +

+ + + + - стимуляция роста + + + - нормальный рост

Отмечен активный рост пропионовокислых бактерий в консорциуме микроорганизмов кефирной грибковой закваски при утилизации лактата, образуемого молочнокислой микрофлорой, что свидетельствует о симбиотических взаимоотношениях микроорганизмов.

Таким образом, приведенные выше результаты свидетельствуют о сочетаемости пропионовокислых бактерий с микрофлорой кефирной грибковой закваски.

Для получения закваски с хорошими биотехнологическими свойствами необходимо подобрать оптимальное соотношение заквасочных культур.

Для выбора соотношения культур составляли различные варианты заквасок и изучали их свойства. В качестве контроля была взята кефирная грибковая закваска. При составлении комбинированной закваски прежде всего учитывали количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий, количество продуцируемого ими витамина В 12 , продолжительность образования сгустка и органолептические свойства. Полученные результаты представлены в таблице 3.

В результате проведенных исследований установлено, что уменьшение содержания клеток пропионовокислых бактерий приводит к резкому снижению содержания витамина В 12 в заквасках.

Результаты исследований показали, что динамика кислотообразования во всех образцах достаточно равномерная. В закваске с соотношением культур 1:1 сгусток формируется быстрее, чем в других образцах.

Из анализа данных таблицы 3 видно, что уменьшение дозы пропионовокислых бактерий в закваске приводит к снижению содержания витамина В 12 , летучих жирных кислот и СО 2 . При этом количество клеток пропионовокислых бактерий в конце ферментации достигает 10⁹ к.о.е. в см³, что свидетельствует об активном росте пропионовокислых бактерий в консорциуме микроорганизмов. В результате проведенных исследований выбрано оптимальное соотношение кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий 1:1. Данное соотношение комбинированной закваски характеризуется наиболее высоким содержанием жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий – 5 ⋅ 10⁹ и витамина В 12 – 536,3 мкг/мл, а также хорошими органолептическими свойствами.

Результаты проведенных исследований показали возможность совместного культивирования кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий.

В дальнейших исследованиях были изучены антимутагенные свойства комбинированной закваски.

Рост и метаболическая активность бактерий служат фундаментальными факторами для получения биомассы и промышленно ценных продуктов. К этим факторам следует добавить еще одно важное свойство бактерий - биосинтез соединений, обладающих антимутагенным и антиканцерогенным действием.

Выбор оптимального соотношения культур в комбинированной закваске

Показатель	Характеристика комбинированной закваски при различном соотношении культур (кефирные грибки : пропионовокислые бактерии)
	Варианты комбинированной закваски
	1:1	1:0,8	1:0,5	Контроль
Консистенция и внешний вид	Однородная, нежная, сметанообразная	Однородная, в меру вязкая	Жидкая, однородная	Однородная, с нарушенным сгустком
Вкус и запах	Кисломолочный, освежающий	Вкус и запах чистые, кисломолочные	Выраженный кисломолочный, излишне «кефирный», слегка острый	Кисломолочный, освежающий
Цвет	Молочно-белый
Продолжительность сквашивания, ч	5,5-6,0	6,5-7,0	7,0-7,5	10-12
Титруемая кислотность, °Т	72	74	74	85
рН	4,83	4,75	4,75	4,35
Количество витамина В12, мкг/мл	536,3	467,5	196,3	0,75
Летучие жирные кислоты, мл 0,1 н NaОН	1,0	0,8	0,6	0,5
Наличие диацетила	+	+	+	+
Наличие ацетоина	+	+	+	+
Наличие СО2, мм	10	8	6	5
Количество жизнеспособных клеток Pr. Shermanii , к.о.е./см3	5x10 9	2x10 9	1х109	-

Под антимутагенезом понимают снижение частоты спонтанной и индуцированной мутации. Антимутагены регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизируют мутационный процесс.

В целом проблема антимутагенеза и антимутагенных свойств бактерий имеет большое будущее, ибо включает в себя как вопросы здоровья людей, так и фундаментальные вопросы биологии.

Изучение антимутагенеза важно именно в отношении тех бактерий, которые используют при изготовлении кормовых добавок и пищи. Бактерии-пробиотики как источники биоантимутагенов или дисмутагенов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов и кормов с целью нейтрализации мутагенных (канцерогенных) веществ.

Пропионовокислые бактерии известны выраженным антимутагенным действием. Поскольку в естественных условиях микроорганизмы постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировались эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению антимутагенеза. Антимутагены пропионовокислых бактерий повышают активность ферментных систем, участвующих в детоксикации поступающих в клетку веществ, оказывая влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма - эти процессы приводят к снижению мутаций. Однако антимутагенез кефирных грибков до сих пор не изучен. В связи с этим была исследована анти-мутагенная активность комбинированной закваски. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Определение антимутагенной активности комбинированной закваски

Таблица 4

Вид микроорганизмов	Среднее число ревертантов на чашку	Ингибирование, %
Кефирная грибковая закваска	885	30,0
Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 186	502	47,2
Комбинированная закваска	532	57,8

В результате экспериментальных исследований установлено, что кефирная грибковая закваска обладает достаточно высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-N-оксидом. Следует отметить, что степень ингибирования на 17% ниже, чем у пропионовокислых бактерий. Наиболее сильное ингибирующее действие обнаружено у комбинированной закваски. Вероятно, более высокая антимутагенная активность комбинированной закваски объясняется тем, что микроорганизмы закваски синтезируют значительные количества антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Одновременное присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях.

Таким образом, установлено, что кефирная грибковая закваска обладает выраженной антимутагенной активностью. Кроме того, введение пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышает антимутагенные свойства комбинированной закваски.

Выводы

• 1.    Установлено, что при совместном культивировании пропионовокислых бактерий с кефирной грибковой закваской отсутствуют явления антагонизма.

• 2.    Подобрано оптимальное соотношение культур пропионовокислых бактерий и кефирной грибковой закваски, обеспечивающее высокий синтез биологически активных веществ и количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий.

• 3.    Выявлено, что комбинированная закваска обладает выраженными антимутагенными свойствами.