Разработка схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией

Лейкоз крупного рогатого скота , имеющий повсеместное широкое распространение , остается одной из наиболее актуальных проблем животноводства в виду нанесения данной отрасли сельского хозяйства ощутимого экономического ущерба [1, 2, 3, 4, 5].

Лабораторно - диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад Bovine Leukemia virus (BLV) являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий [4, 5].

Ранее разработанные способы типизации ВЛКРС на основе ПЦР - ПДРФ - анализа [1, 2, 3], несмотря на определенную идентификационную ценность , всё же не позволяют охарактеризовать весь спектр генетического многообразия BLV, нежели филогенетическая классификация , предложенная S.M. Rodriguez et al. (2009) [5], и регламентирующая наличие 7 генотипов у данного инфекционного агента .

Целью данной работы являлся сравнительный анализ представителей ВЛКРС на предмет их классификации в контексте предложенных стратегий типизации с дальнейшим усовершенствованием схемы генотипической идентификации BLV по локусу env-гена возбудителя.

Материалы и методы . В работе были использованы 2 изолята ВЛКРС : «N10» и «N28», выделенные от кр . рог . ск . из Мензелинского и Спасского районов Республики Татарстан , соответственно .

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР , генерирующая амплификацию фрагмента env - гена ВЛКРС длиной 444 п . н . [1, 2, 3].

Эндонуклеазы рестрикции , использованные для ПЦР - ПДРФ - анализа : Ksp22I , HaeIII , BamHI , PvuII, DdeI, SspI и AsuHPI .

ПЦР - ПДРФ - фрагменты разгоняли в 2,5% агарозном геле (20 В / см , 40 мин ) и визуализировали в УФ - трансиллюминаторе ( λ =310 нм ).

ПЦР - ПДРФ - моделирование : NEBcutter v.2.0.

Секвенирование продуктов амплификации локуса env - гена BLV с внутренними праймерами «env5099» и «env5521» изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО « СибЭнзим ».

Изоляты «N10» (GenBank A/N: HM102355) и «N28» (GenBank A/N: HM102356) были выравнены по длине 444 нуклеотидов локуса env - гена c соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями представителей известных генотипов BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) с последующим филогенетическим анализом .

Результаты исследования и их обсуждение . В результате исследования 2- х выделенных нами изолятов ВЛКРС на предмет их таксономической принадлежности , установлено , что в зависимости от выбранной стратегии типизации на основе ПЦР - ПДРФ - анализа , изолят «N10» BLV относится к Бельгийскому подтипу ( по D. Beier et al. 2001, [1]), к 6- му генотипу ( по M. Licursi et al. (2002) [3]), и к группе «A» ( по H Fechner, 1997 [2]); а изолят «N28» BLV характеризуется признаком Австралийского подтипа ( по D. Beier et al. 2001, [1]), 1- го генотипа ( по M. Licursi et al. (2002) [3]), и группы « С » ( по H Fechner, 1997 [2]). По филогенетической же классификации , предложенной S.M. Rodriguez (2009) [5], изоляты «N10» и «N28» принадлежат к кластерам 4- го и 7- го генотипов , соответственно .

При сравнительном анализе 184 заявленных в GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей изолятов BLV на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено , что известные ранее способы типизации представителей BLV, разработанные на основе ПЦР - ПДРФ - анализа [1 2, 3], не согласуются с новым подходом оценки генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа env - гена [4, 5] ( табл . 1).

• 1.    Классификация заявленных в GenBank NCBI изолятов BLV в зависимости от выбранной стратегии типизации ( количественное отношение )

  ТИПИЗАЦИЯ			ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
  			ГЕНОТИПЫ
  			1- ый	2- ой	3- ий	4- ый	5- ый	6- ой	7- ой
  ! ё в В	в -н ^ 4 0 в	Бельгийский				17
  		Австралийский	49		4			8	4
  		Японский	8					2
  		?	42	37		1	10		2
  	Н m 0 “ В ы ^	1- ый	87			1		7	4
  		2- ой
  		3- ий	8					2	1
  		4- ый
  		5- ый	1		4			1
  		6- ой		36		17	8
  		?	3	1			2		1
  	Рн b	A				17
  		B	8					2	1
  		C	48		4			8	4
  		D	39			1
  		E
  		F		36			8
  		G	1
  		?	3	1			2		1

  Дальнейшие исследования были направлены на разработку схемы ПЦР - ПДРФ - генотипирования ВЛКРС , согласующейся с филогенетической классификацией , предложенной S.M. Rodriguez (2009) [5], для чего , на первом этапе , провели скрининг известных эндонуклеаз рестрикций путем моделирования ПЦР - ПДРФ - профилей нуклеотидных последовательностей локуса env - гена представителей известных генотипов BLV с последующим формированием оптимального протокола идентификации .

• 2.    Env - ПЦР - ПДРФ - профили BLV ( праймеры env5099-env5521)

  Г	Типовой изолят	GenBank A/N	ПЦР - продукт ( п . н .)	ПДРФ - фрагменты ( п . н .)					К	N
  				BamHI	PvuII	DdeI	SspI	HphI ( AsuHPI )
  1	AL-63	FJ808571	444	316/128	444	444	399/45	224/220	1	57
  1	AL-2106	FJ808578	444	444	444	444	399/45	224/220	2	37
  1	Uru38	FM209471	444	444	444	330/114	399/45	224/220	3	3
  1	VdM	M35239	444	316/128	444	444	399/45	224/181/39	4	1
  1	Kurdista n	EU266062	444	316/128	444	444	399/45	220/196/28	5	1
  2	AL-164	FJ808574	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/220	6	35
  2	ARGSF8	AF485773	444	316/128	280/164	276/168	399/45	444	7	1
  2	AL-1453	FJ808577	444	316/128	280/164	276/168	444	224/220	8	1
  3	JPFU	EF065650	444	316/128	444	276/168	399/45	444	9	4
  4	BG	EF065638	444	444	280/164	276/168	399/45	224/220	10	16
  4	N10	HM102355	444	444	280/164	168/162/114	399/45	224/220	11	1
  4	3	U87872	444	444	444	168/162/114	399/45	224/220	12	1
  5	CRAS-2	EF065636	444	316/128	280/164	276/168	399/45	224/181/39	13	8
  5	CRLC-1	EF065655	444	316/128	280/164	276/168	444	224/181/39	14	2
  6	PL-1238	FJ808582	444	316/128	444	276/168	399/45	224/220	15	10
  7	N28	HM102356	444	316/128	444	276/168	444	224/137/83	16	3
  7	I2	S83530	444	316/128	444	276/168	444	224/220	17	1
  7	14	AY515274	444	316/128	444	276/168	444	145/137/83/ 79	18	1
  7	30	DQ059417	444	316/128	444	276/168	444	444	19	1

Обобщенная информация с интерпретацией полученных env - ПЦР - ПДРФ - профилей ВЛКРС представлена в табл . 2.

Установлено , что для выделенных нами изолятов характерны соответствующие комбинации ПЦР - ПДРФ - профилей : для изолята «N10» – комбинация № 11; для изолята «N28» – комбинация № 16 ( табл . 2).

Следует подчеркнуть , что рассчитанная в результате секвенирования продуктов ПЦР - амплификации точная картина ожидаемых ПДРФ - фрагментов ДНК изолятов «N10» и «N28» ВЛКРС , в дальнейшем , была воспроизведена нами экспериментально .

Обозначения: Г – генотип; К – комбинация; N – количество известных изолятов BLV с соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей.

Распределение фрагментов рестрикции , полученных при эндонуклеазном расщеплении ПЦР - продуктов ферментами BamHI, PvuII , DdeI , SspI и AsuHPI, представлено на рис . 1.

На рис . 1 видно , что при обработке ПЦР - продукта от изолята «N10» ферментом BamHI ПДРФ - фрагментов не образуется ввиду отсутствия соответствующего сайта рестрикции в анализируемом локусе env - гена . PvuII расщепляет ампликон на 2 фрагмента – 280 и 164 п . н ., DdeI – на фрагменты 168, 162 и 114 п . н ., SspI – 399 и 45 п . н ., AsuHPI – 224 и 220 п . н .

Полученный ампликон от изолята «N28» расщепляется эндонуклеазой рестрикции BamHI на фрагменты длиной 316 и 128 п . н ., DdeI – 276 и 168 п . н ., а рестриктазой AsuHPI на 224, 137 и 83 п . н .. Ферменты PvuII и SspI в данном локусе env - гена изолята «N28» ПДРФ - фрагментов не образуют из - за отсутствия соответствующих сайтов рестрикции ( рис . 1).

1. Электрофореграмма env - ПЦР - ПДРФ - профилей изолятов N10 и N28 BLV Обозначения : 1.0-1.5) ПЦР - ПДРФ - профиль изолята N10 BLV: 1.0) ПЦР - продукт (444 bp); 1.1) BamHI - ПДРФ (444 bp); 1.2) PvuII - ПДРФ (280/164 bp); 1.3) DdeI - ПДРФ (168/162/114 bp); 1.4) SspI - ПДРФ (399/45 bp); 1.5) AsuHPI - ПДРФ (224/220 bp). М ) ДНК - маркеры 100-1000 bp ( СибЭнзим ). 2.0-2.5) ПЦР - ПДРФ - профиль изолята N28 BLV: 2.0) ПЦР - продукт (444 bp): 2.1) BamHI - ПДРФ (316/128 bp); 2.2) PvuII - ПДРФ (444 bp); 2.3) DdeI - ПДРФ (276/168 bp); 2.4) SspI - ПДРФ (444 bp); 2.5) AsuHPI - ПДРФ (224/137/83 bp).

Заключение . Подобранные нами условия проведения ПЦР - ПДРФ - анализа с использованием 5 ферментов BamHI, PvuII , DdeI , SspI и AsuHPI позволяют идентифицировать генотипы ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией BLV [4. 5].

Следует отметить , что 1- ый генотип ВЛКРС характеризуется наличием пяти комбинаций ПЦР - ПДРФ профилей ( К 1-5); 2- ой генотип – трех комбинаций ( К 6-8), 3- ий генотип – наличием одной комбинации ( К 9); 4- ый генотип – трех комбинаций ( К 10-12); 5- ый генотип – двух комбинаций ( К 13-14); 6- ой генотип – одной комбинации ( К 15), и 7- ой генотип – наличием четырех комбинаций ( К 16-19) ( табл . 2).

Примечательно , что для идентификации 1- го генотипа достаточно даже одной эндонуклеазы рестрикции – DdeI . С использованием двух ферментов могут быть определены представители 4- го ( BamHI и DdeI ), 5 го ( PvuII и AsuHPI ) и 7- го генотипов ( PvuII и SspI ) BLV ( табл . 2).

В целях же исчерпывающей идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной env - ПЦР - ПДРФ - профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР - продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по env - гену данного возбудителя .

ЛИТЕРАТУРА : 1. Beier, D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein, O.

Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr – 2001. – V. 114. – № 7-8. – P. 252-256. 2. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein, A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt, D. Ebner // Virology –1997. – V. 237. – № 2. – P. 261-269. 3. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. González, H. Sentsui // Virus Res. – 2002. – V. 86. – № 1-2. – P. 101-110. 4. Moratorio, G. Phylogenetic analysis of bovine leukemia viruses isolated in South America reveals diversification in seven distinct genotypes / G. Moratorio, G. Obal, A. Dubra, A. Correa, S. Bianchi, A. Buschiazzo, J. Cristina, O. Pritsch // Arch. Virol. – 2010. – V. 155. – № 4. – P. 481-489. 5. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones //J Gen Virol. – 2009. – V. 90. – № 11. – P. 2788-2797.

РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПЦР - ПДРФ - ГЕНОТИПИРОВАНИЯ BLV В СООТВЕТСТВИИ С ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КЛАССИФИКАЦИЕЙ

Шаева А . Ю ., Вафин Р . Р ., Хазипов Н . З ., Камалов Б . В ., Алимов А . М ., Тагиров М . Ш .

Резюме

Целью данной работы являлся сравнительный анализ представителей ВЛКРС на предмет их классификации в контексте предложенных стратегий типизации с дальнейшим усовершенствованием схемы генотипической идентификации BLV по локусу env - гена возбудителя . Подобранные нами условия проведения ПЦР - ПДРФ - анализа с использованием 5 ферментов BamHI, PvuII , DdeI , SspI и AsuHPI позволяют идентифицировать генотипы ВЛКРС в соответствии с филогенетической классификацией BLV.

DEVELOPMENT OF THE SCHEME OF PCR-RFLP-GENOTYPING BLV IN ACCORDANCE WITH PHYLOGENETIC CLASSIFICATION

Shaeva A.Y., Vafin R.R., Khazipov N.Z., Kamalov B.V., Alimov A.M., Tagirov M.Sh.