Регенерация перирубцовой зоны миокарда при комбинированной реваскуляризации (лазер плюс клетки) на модели хронической ишемической болезни сердца

На сегодняшний день, остается неясной возможность регенерации миокарда «взрослого сердца» вообще и в условиях улучшения микроциркуляторного русла. Сейчас считается, что кардиомиоциты (КМЦ) сердца человека после года от момента рождения не способны к гиперпластической регенерации, возможна только внутриклеточная регенерация. Более того, рядом авторов было показано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не меняется [6, 11].

Однако ряд экспериментальных исследований последних лет и клинических наблюдений в области трансплантологии позволил предположить несколько гипотез клеточного обновления миокарда: регенерация миокарда может происходить за счет пролиферации резидентных (эндогенных) стволовых клеток миокарда при его повреждении; показана возможность трансдифференцировки клеток костномозгового происхождения в кардиоциты [5, 12, 14, 15].

Цель нашей работы - анализ репаративных процессов кардиоцитов перирубцовой зоны в условиях изменения микроциркуляции после комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации и имплантацией в лазерные каналы мононуклеарной фракции клеток костного мозга (МНФ ККМ).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 14 беспородных собаках массой от 11 до 14 кг. Всем животным выполнялась моделирование острого инфаркта миокарда, спустя 3 месяца, 9 животным проводилась комбинированная реваскуляризация миокарда перирубцовой области. В 8-12 лазерных каналов имплантировались аутологичные клетки МНФ КМ. Суммарное количество имплантируемых клеток 5 х 106. Детальное описание методики реваскуляризации и клеточного процессинга представлены в следующих публикациях [1,2, 4]. Для профилактики эктопической оссификации был обязательным этап сепарации МНФ ККМ на пластике 30 мин [2, микроциркуляция, регенерация, кардиомиоцит.

• 3] . Через месяц после комбинированной реваскуляризации животные выводились из эксперимента. Пять животных с постинфарктным рубцом были использованы в качестве контроля время экспозиции ишемии 3 месяца.

Для морфологической оценки использованы фрагменты миокарда левых желудочков миокарда перирубцовой области.

Плотность артериол оценивалась по позитивной реакции на выявление щелочной фосфатазы ЩФ. Среда для демонстрации ЩФ - 25 мг нафтола AS-BI фосфата растворяли в 0,5 мл №,№-диме-тилформамида, затем добавляли 50 мл 0,1 М трис-HCl буфера pH 9,2. Реакцию оценивали визуально, только на поперечных срезах сосудов.

Для оценки микроциркуляторного русла срезы окрашивались изолектином GS-IB 4 меченным флюорофором AlexaFluor 594 (Invitrogen Lot. 404250) (рис. 1) в концентрации 1:100 на 0,1 МФСБ с использованием Multi-Shaker PSU-20 на протяжении 11 ч при комнатной температуре. При подсчете капилляров миокарда учитывались волокна миокарда с поперечным профилем, которые включались в анализируемые площади при их выделении. Для анализа изображений использовали программноаппаратный комплекс на базе микроскопа Axioskop FL-40 c камерой AxioCam MRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 3.1, его программные модули ручных измерений и для получения изображений модуль MultiChannel, объектив Plan-Neofluar х 40 с конечным увеличением 460 крат, блоками фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615 и filter set 09 BR 450-490, FT 510, LP515 Carl Zeiss).

Проводилась флюоресцентная кардиометрия миокарда (рис. 2). Срезы окрашивались в водном растворе, содержащим 10pG/mL ethidium bromide, 9 мин при комнатной температуре. Анализировались следующие параметры: средняя численная плотность ядер на тестовую площадь (M±m), средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь M±m (мкм2), средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда (M±m) (%), сред-

Рис. 1. Флюоресцентная метка Alex-flu на изолектине B4, определяются капилляры миокарда - краснооранжевые. Контрастер-аутофлюоресценция. Объектив х 40.

Рис. 2. Окрашивание этидиумом бромидом, на ядрах денситометрические показатели. Объектив х 63.

няя площадь ядра M±m (мкм2), средний «идеальный» диаметр ядра исходя из средней площади миокарда M±m (мкм2). Денситометрический максимум ядер кардиоцитов и денситометрический минимум был одного уровня для изучаемых групп. Аналитическое увеличение 630 крат, тестовая площадь одного изображения 39437 мкм2.

Для получения изображений и их анализа использовался микроскоп M200 c камерой AxioCam HRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 4.7, программный модуль автоматических измерений, объектив Neofluarх63, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).

Статистический анализ результатов, выполнен с помощью программных пакетов Microsoft Excel и OriginPro 7.0. с использованием критериев ANOVA в доверительном интервале P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Средняя численная плотность артериол миокарда перирубцовой области в экспериментальной группе с реваскуляризацией, составила 124±4,7/мм2 против 95±0,4/мм2 в контроле (P<0,05).

Наши результаты, показывающие увеличение численной плотности артериол в области комбинированной реваскуляризации, близки к результатам полученным авторами при выполнении ТМЛР, так же использовавшим модель хронической ишемии у крупных животных [7, 8].

Средняя численная плотность капилляров миокарда перирубцовой области в экспериментальной группе составила 2938±68,8/мм2 против 2144±93,6/мм2, в контроле ХИБС, (P<0,05). В близком эксперименте, на модели хронической ишемии миокарда у свиней, изучая эффекты имплантации в миокард клеток МНФ КК, через 12 недель после инъекции, нашли увеличение плотности капилляров до 1132±69/мм2, против 903±44/мм2 в контроле, что в процентом выражении показывают увеличение плотности капилляров на 25%, у нас же на 37% [13].

Результаты, представленные в табл. 1, показывают практически двукратное увеличение средней суммы площадей ядер и среднего процента площади ядер кардиоцитов, а также значимое увеличение численной плотности ядер, в группе с воздействием на миокард перирубцовой области «лазер плюс клетки», при сравнении с аналогичными показателями в контроле. Более того, размеры самих ядер при оценке таких параметров как средний «идеальный» диаметр и средняя площадь ядра также увеличиваются в группе с комбинированной реваскуляризацией (табл. 2).

Таблица 1

Средняя сумма площади ядер на тестовую площадь 39437 мкм2, средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда, средняя численная плотность ядер на тестовую площадь 39437 мкм2

Миокард перирубцовой области	Средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь, 2 мкм	Средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда, (%)	Средняя численная плотность ядер на тестовую площадь
Контроль ХИБС	465,6±37,1	1,18±0,094	22,0±1,52
Лазер+клетки	972,3±98,2*	2,19±0,122*	29,7±1,32*

* P<0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way

Новые научные разработки и технологии

Таблица 2

Средняя площадь ядра кардиоцита, средний «идеальный» диаметр ядра по предварительным расчетам средней площади ядра

Миокард перирубцовой области	Средняя площадь ядра, 2 мкм	Средний «идеальный» диаметр ядра, исходя из его средней площади, мкм2
Контроль ХИБС	21,0±0,38	5,02±0,04
Лазер+клетки	32,6±0,64*	6,04±0,04*

* P<0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVa one way

Привлекательно в проекции наших данных, выглядят результаты, полученные Н. Lim с соавторами [10], которые при использовании модели хронической ишемии у свиней с трехмесячной экспланацией ишемии, обнаружили регионарную потерю ядер кардиоцитов (35%) за счет включения механизмов апоптоза. Эта была первая работа, показавшая связь между хронической регионарной ишемией и ишемической кардиомиопатией.

В этом смысле увеличение размеров самих ядер, в группе с комбинированной реваскуляризацией, прямо говорит об участии антиапоптоти-ческих механизмов клеточной терапии, и включении регенерации кардиоцитов перирубцовой зоны в большей степени за счет паракринных эффектов [9].

Заключая можно с определенной долей уверенности говорить о возможности восстановления функций кардиоцитов в области комбинированного воздействия лазер плюс клетки в условиях восстановления микроциркуляторного русла.