Реорганизация синаптоархитектоники сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского-Молодкиной после однократного шумового воздействия выше предельно допустимого уровня

В связи с тем, что в России заболевания, связанные с воздействием вредных физических факторов производства, наиболее распространенным из которых является шум [1, 2, 3], занимают наибольший удельный вес в структуре хронических профессиональных заболеваний и включены в «Перечень профессиональных заболеваний» [4]. Представляет интерес экспериментальное изучение воздействия шума, превышающего ПДУ, на синаптоархитектонику КГМ. Установлено, что шумовые воздействия вызывают нарушение долговременной памяти, способности к обучению и поведенческие реакции у крыс Вистар и линии Крушинского – Молодкиной [5].

Объекты и методы

В качестве экспериментальных животных использовали крыс линии Крушинского – Молодкиной (К-М; n = 90) с генетически детерминированной высокой чувствительностью к шумовому воздействию (ШВ), предоставленных виварием лаборатории физиологии и генетики

поведения кафедры высшей нервной деятельности биолого-почвенного факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 27.07.78 об обеспечении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными. Однократное шумовое воздействие (ОШВ) превышало предельно допустимый уровень (ПДУ = 80 дБ А) и равнялось 86 дБ А. Реакцию на шумовой раздражитель оценивали по методу Л.В. Крушинского [6] в звукоизолированной прозрачной камере (40 × 60 × 50 см), позволяющей вести визуальное наблюдение за двигательной активностью и психосоматическим состоянием животных.

Для электронно-микроскопического исследования кору головного мозга (КГМ) крыс (поле F^pa и F^pp) фиксировали погружением в смеси 1 %-ного раствора глютарового альдегида и 4 %-ного раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %). Затем материал отмывали в фосфатном буфере в течение 1 ч, дофиксировали в 1 %-ном растворе четырехокиси осмия в течение 2 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Тангенциальные ультратонкие срезы коры контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Осмированный материал использовали для качественной и количественной оценки состояния нейронов, их отростков, синапсов и глиоцитов. Для селективного выявления синаптического цитоскелета ССЕ (система субсинаптических единиц) - плотные проекции, постсинаптическое уплотнение – использовали контрастирование в 1 %-ном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) на абсолютном спирте (100 %) (ФВК) [7, 8]. Фотографировали на электронном микроскопе 100 АКА. На электронограм-мах определяли общую численную плотность синапсов (ОЧПС) на 100 мкм² нейропиля, выделяли симметричные, асимметричные и смешанные синапсы, плоские, положительно и отрицательно искривленные, неперфорированные и перфорированные, синапсы с низкими, средними и высокими плотными проекциями (типы А, В, С), очень мелкие, мелкие, средние, крупные и очень крупные. Вычисляли площадь активной зоны (АЗК), площадь свободной от АЗК поверхности шипика (СПШ), отношение СПШ/АЗК, средний диаметр АЗК, суммарную длину АЗК на 100 мкм² нейропиля [7, 8]. Случайным образом выбранные участки фотографировали при стандартном увеличении в 15000 раз. Обработку материала проводили на цифровых изображениях негативов с помощью программы ImageJ 1.46. В качестве контроля использовали крыс линии К-М без ШВ.

Статистический анализ полученного материала проводили с использованием стандартного пакета прикладных статистических программ Statistica 6.0 [9]. Проверку статистических гипотез проводили с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Нулевая гипотеза отвергалась при p < 0,05.

Результаты исследований и обсуждение

У животных контрольной группы среди функционально зрелых контактов, которые составляли 82,2 % от общего количества синапсов, содержание плоских, вогнутых и выпуклых контактов 1,4 : 1,1 : 1,0. Незрелые контакты были представлены только плоскими синапсами и составляли 17,8 % от общего количества (табл. 1). Численная плотность симметричных и асимметричных контактов 1 : 4,6. Преобладали функционально зрелые синапсы групп А и В мелких и средних размеров (табл. 2 и 3). ССЕ этих синапсов имела четкие контуры. Отношение СПШ/АЗК равнялось 2,55 (табл. 4). ССЕ имела структурную связь с окружающим ФВК-позитивным материалом цитоскелета пре- и постсинаптической зоны синапсов. После ОШВ ОЧПС уменьшалась и через 4, 8 и 24 ч составляла соответственно 67,7; 95,0 и 51,4 % от контроля. Редукция синапсов осуществлялась за счет всех разновидностей симметричных и асимметричных контактов (табл. 1).

Через 4 ч после ОШВ численная плотность синапсов снижалась на 32,3 %. На 23,2 % увеличивалось относительное содержание положительно искривленных контактов, а содержание плоских форм зрелых контактов снижалось на 13,6 % (рисунок). Относительное содержание асимметричных отрицательно искривленных и симметричных плоских контактов сохранялось на контрольном уровне. Уменьшалось содержание очень мелких, мелких синапсов и синапсов с высотой ПП 50 нм и менее, увеличивалось содержание очень крупных синапсов. Уменьша- лось отношение СПШ/АЗК, укорочение и утолщение шейки дендритов. Выявлялись синапсы с деструктивно измененными ПП: снижалась четкость контуров ПП, их высота, фрагментация и отрыв ПП от пресинаптической мембраны. В некоторых синапсах часть ПП контакта разрушалась полностью. Постсинаптическое уплотнение (ПСУ) повреждалось в меньшей степени.

Таблица 1

Численная плотность контактов с различной организацией системы субсинаптических единиц в нейропиле слоя I сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной после однократного шумового воздействия, M ± m

Показатель	Контроль	Время после ОШВ, часы
		4	8	24
ОЧПС на 100 мкм2 нейропиля	17,9 ± 0,41	11,97 ± 0,12*	16,79 ± 0,30	9,10 ± 0,11*
Асимметричные: всего плоские (+) искривленные ( - ) искривленные	14,54 ± 0,28 5,88 ± 0,42 4,58 ± 0,23 4,08 ± 0,11	10,50 ± 0,15* 2,35 ± 0,12* 5,87 ± 0,21* 2,28 ± 0,13*	15,61 ± 0,41 5,75 ± 0,33 5,87 ± 0,31 4,02 ± 0,58	8,05 ± 0,21* 3,49 ± 0,20* 2,38 ± 0,12* 2,28 ± 0,30*
Симметричные: всего плоские	3,15 ± 0,20 3,15 ± 0,20	1,41 ± 0,11* 1,41 ± 0,11*	1,18 ± 0,11* 1,18 ± 0,11*	1,05 ± 0,21* 1,05 ± 0,21*
Диаметр АЗК, нм	372,8 ± 34,3	434,7 ± 40,0	430,3 ± 39,6	584,4 ± 53,8*
Суммарная длина АЗК, нм	6595 ± 608	5203 ± 479	7225 ± 665	5318 ± 490

Таблица 2

Численная плотность синапсов с различной длиной активной зоны контакта в молекулярном слое сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной в различные сроки после однократного шумового воздействия (ФВК-метод ), M ± m

Длина АЗК, нм	Контроль	Время после ОШВ, часы
		4	8	24
< 200	1,01 ± 0,02	0,46 ± 0,05*	0,77 ± 0,01*	0,29 ± 0,04*
201 – 400	7,92 ± 0,52	3,56 ± 0,30*	6,01 ± 0,01*	0,47 ± 0,01*
401 – 600	4,50 ± 0,23	3,81 ± 0,40	3,42 ± 0,06*	1,54 ± 0,02*
601 – 800	3,24 ± 0,39	2,73 ± 0,30	4,61 ± 0,08*	4,17 ± 0,05*
> 800	1,02 ± 0,04	1,41 ± 0,01*	1,98 ± 0,04*	2,63 ± 0,03*

Таблица 3

Количество асимметричных контактов с различной высотой плотных проекций в слое I сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной в различные сроки после однократного шумового воздействия (ФВК-метод), M ± m

Время после ОШВ, часы	Количество синапсов с различной высотой плотных проекций на 100 мкм2 нейропиля
	> 60 нм	60–51 нм	50 нм и <
Контроль	6,26 ± 0,37	5,04 ± 0,29	3,24 + 0,16
4	3,01 + 0,18*	5,46 + 0,31	2,03 ± 0,10*
8	5,04 ± 0,30	7,21 + 0,41 *	3,36 + 0,17
24	3,92 ± 0,34*	2,09 + 0,15*	2,04 + 0,14*

Таблица 4

Дендритные шипики слоя I сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной в различные сроки после однократного шумового воздействия, M ± m

Показатель	Контроль	Время после ОШВ, часы
		4	8	24
Площадь АЗК, нм2	109111 ± 926	148320 ± 1259*	145359 ± 1233*	268091 ± 2275*
СПШ, нм2	278233 ± 2361	344102 ± 2919*	382295 ± 3243*	726527 ± 6164*
СПШ/АЗК	2,55	2,32	2,63	2,72

Примечание. В табл. 1 – 4 символ «_*» обозначает, что в сравнении с контролем различия статистически значимы при р < 0,05 (t – критерий Стьюдента для независимых выборок). АЗК – активная зона контакта; ОШВ – однократное шумовое воздействие; ПП – плотные проекции; СПШ – свободная поверхность шипика; ОЧПС – общая численная плотность синапсов. Материал представлен как среднее (M) ± стандартная ошибка средней (m).

А

Б

Нейропиль сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной:

А - контроль, преобладают плоские контакты; Б - через 4 часа после однократного шумового воздействия выше предельно допустимого уровня; увеличение относительного содержания положительно искривленных функционально зрелых синапсов; Д - дендрит; стрелки - синапсы. Контрастирование цитратом свинца и уранилацетатом после дофиксации 1 %-ным раствором четырехокиси осмия. Ув. × 18000, шкала - 500 нм

Через 8 ч после ОШВ общее количество выявляемых межнейронных контактов на 100 мкм2 снижалось на 5,1 %. Относительное содержание положительно искривленных контактов уменьшалось на 14,1 % по сравнению с предыдущим сроком, а содержание плоских контактов возрастало на 14,6 %. При этом по сравнению с контролем на 10,8 % уменьшалось содержание плоских симметричных контактов, а содержание отрицательно искривленных оставалось на уровне контроля. Увеличивалось количество крупных и очень крупных контактов, уменьшалось содержание синапсов с очень мелкой, мелкой и средней АЗК, увеличивались число синапсов с высотой ПП 51–60 нм, площадь АЗК и свободной от АЗК поверхности шипика, удлинялась и истончалась шейка дендритных шипиков.

Через 24 ч после ОШВ численная плотность выявляемых межнейронных контактов снижалась на 48,6 %. Относительное содержание положительно искривленных контактов становилось равным контролю, а количество плоских синапсов не отличалось от предыдущего срока и контрольного уровня. К концу суток после пароксизма происходило восстановление относительного содержания функционально зрелых и незрелых контактов, хотя абсолютное количество выявляемых синапсов на 100 мкм2 оставалось ниже, чем в контроле. Увеличивался средний диаметр контактов за счет увеличения количества крупных и очень крупных синапсов. Как и в контроле преобладали синапсы с высотой ПП более 60 нм. Возрастала площадь АЗК и свободной от АЗК поверхности шипика, удлинялась и истончалась шейка дендритных шипиков.

Закл ючение

Таким образом, ОШВ выше предельно допустимого уровня сопровождается изменениями синаптоархитектоники сенсомоторной КГМ, которые к концу суток после ОШВ не проходят полностью. Уменьшается численная плотность контактов. В первые часы после ОШВ часть межнейронных контактов из функционально неактивного состояния переходят в активное состояние передачи нервного импульса, что документируется увеличением относительного содержания положительно искривленных и уменьшением содержания плоских функционально зрелых синапсов. Активированное состояние межнейронных связей сохраняется в течение 4 ч после ОШВ и относительно нормализуется к концу суток. Через 24 ч после ОШВ увеличивается средний диаметр сохранившихся синапсов, уменьшается суммарная длина контактов на 100 мкм2 нейропиля, увеличивается относительное содержание крупных и очень крупных синапсов и синапсов с высотой ПП 51–60 нм. Восстановление синаптического пула происходит посредством трансформации незрелых плоских симметричных контактов в функционально зрелые асимметричные плоские контакты.

Выводы

Однократное шумовое воздействие, превышающее предельно допустимый уровень, вызывает качественные и количественные изменения синапсов в слое I сенсомоторной коры головного мозга у крыс линии Крушинского – Молодкиной. Через 4 часа после воздействия увеличивается содержание активных (положительно искривленных) синаптических контактов. Через 24 ч увеличивается средний диаметр сохранившихся синапсов, относительное содержание крупных и очень крупных синапсов и синапсов с высотой плотных проекций 51–60 нм, уменьшается суммарная длина контактов на 100 мкм2 нейропиля. Частичное восстановление синаптического пула к концу суток после шумового воздействия происходит за счет превращения незрелых плоских симметричных контактов в функционально зрелые асимметричные контакты.