Результаты лабораторного контроля гистамина в рыбе и рыбных продуктах методом ВЭЖХ МС/МС

Биогенные амины (БА) представляют собой основные азотистые соединения разнообразной структуры и встречаются во многих видах пищевых продуктов, таких как рыба и рыбная продукция, мясо и мясная продукция, сыры, алкогольная продукция (вино, пиво) и другие ферментированные продукты и напитки [11]. Они могут образовываться вследствие декарбоксилирования аминокислот и аминирования или переаминирования кетонов и альдегидов при взаимодействии бактериальных микроорганизмов [17]. По химической структуре БА делятся на три группы: алифатические, которые включают в себя также спермидин, спермин, кадаверин или путресцин, ароматические, такие как фенилэтиламин или тирамин, а также гетероциклические, например, триптамин или гистамин [1, 14, 17].

Биогенные амины можно найти в любой группе белковосодержащих продуктов. БА являются индикаторами свежести и пригодности к употреблению в пищу человеком определенных продуктов питания, например, рыбы, а в некоторых случаях улучшают органолептические характеристики продуктов питания [11, 18, 20]. Уровень БА также является маркером гигиенического качества пищевых продуктов, указывая при их высоком уровне на несоблюдение гигиенических правил и норм при обработке сырья и наличие многочисленных нежелательных бактерий [5].

Среди БА гистамин считается наиболее биологически активным и токсичным, поскольку употребление в пищу человеком рыбы или рыбной продукции с высоким уровнем его содержания, может стать причиной серьезных пищевых отравлений [3, 16].

Термическое воздействие при приготовлении пищи может инактивировать ферменты, однако, после образования гистамина ни один метод приготовления, включая замораживание, консервирование или копчение не сможет удалить токсины. Токсичность останется неизменной благодаря его термостабильности [13, 19].

В связи с высокой токсичностью гистамина, контроль за его содержанием как в рыбе, так и в рыбной продукции является необходимым для обеспечения безопасности потребителей.

Необходимо отметить, что гистамин – это единственный биогенный амин, содержание которого регулируется на законодательном уровне практически во всех странах мира [10], в том числе и в странах Евразийского экономического союза (ЕАЭС) [1, 4]. Количественное содержание гистамина в пищевой продукции является важным показателем как свежести, так и безопасности при употреблении человеком рыбы и нормируется во всех развитых странах мира. Предельно допустимая массовая доля гистамина в рыбе и рыбопродуктов в России, согласно Технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции»

(ТР ЕАЭС 040/2016) составляет не более 100 мг/кг для рыб семейств тунцовых, скумбриевых, лососевых и сельдевых (кроме икры, молок, печени и жира пищевого из рыбы), в том числе и для сушеной продукции, для рыборастительных консервов – не более 40 мг/кг [1, 4]. По требованиям законодательства Индонезии максимально допустимый уровень содержания гистамина должно составлять 100 мг/кг [7]. Аналогичный уровень гистамина установлен в Канаде [8]. Австралия установила более высокий максимальный предел, а именно 200 мг/кг гистамина как естественного токсина в рыбе и рыбной продукции [6]. Европейская комиссия установила предельно допустимый уровень гистамина для рыбной продукции, которая может накапливать высокие концентрации этого биогенного амина. Согласно Регламенту ЕС 2073/2005, допустимые уровни от 100 до 200 мг/кг, а из девяти наборов проб не более двух проб могут превышать 100 мг/кг гистамина, и ни одна проба не может превышать 200 мг/кг гистамина, а также до 400 мг/кг для продукции из этих же видов рыб, подвергнутой ферментативному созреванию в тузлуке (например, при засолке анчоусов) [9]. Федеральное управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) установило, что максимальное содержание гистамина в рыбе и рыбных продуктах составляет 50 мг/кг. Производители рыбных консервов контролируют качество сырья в соответствии с производственной нормой, установленной на уровне от 5 до 15 мг/кг гистамина [12].

Учитывая, что повышенное содержание гистамина в рыбе и рыбных продуктах может представлять потенциальную опасность для здоровья человека, крайне важно определить и оценить его концентрацию с точки зрения безопасности пищевых продуктов. Очень важным является развитие новых технологических подходов для количественного анализа гистамина в пищевых продуктах. В настоящее время во многих странах мира применяется множество методов для анализа биогенных аминов, включая гистамин в продуктах питания, особенно в рыбе и рыбной продукции [15]. Одним из наиболее точных и селективных методов анализа микропримесей органических соединений, в том числе гистамина, является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ МС/МС) [21].

Необходимость в точных подтверждающих аналитических методах для эффективного мониторинга токсичных веществ в пищевых продуктах привела к разработке специалистами ФГБУ «ВНИИЗЖ» методики количественного определения гистамина методом ВЭЖХ МС/МС [2].

Материал и методы исследований. Проведен анализ результатов мониторинга в части количественного содержания гистамина в подвергнутых лабораторным испытаниям проб рыбы и рыбной продукции, отобранных на территории регионов Российской Федерации за период 20202022 гг. в рамках государственного пищевого мониторинга продовольственной безопасности инспекторами территориальных управлений Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор). Исследования проб рыбы и рыбной продукции проводились в испытательных центрах Россельхознадзора.

В качестве объектов для собственных исследований были выбраны несколько видов консервированной рыбной продукции, таких как «Тунец натуральный» (3 образца), «Тунец натуральный рубленный» (3 образца), «Тунец натуральный в масле для салатов» (3 образца), «Скумбрия натуральная в масле» (4 образца), «Горбуша натуральная» (4 образца) готовой к употреблению рыбной продукции: сельдь атлантическая слабосоленая (3 образца), скумбрия горячего копчения (2 образца), а также три вида мороженной рыбы:

скумбрия (4 образца), атлантический лосось (2 образца), горбуша (2 образца). Продукция была приобретена в сети розничной торговли города Москвы и Московской области.

Исследования образцов рыбы и рыбной продукции на количественное содержание гистамина проводили на базе ФГБУ «ВНИИЗЖ» по методике [2] количественного определения гистамина методом ВЭЖХ МС/МС, основанным на выделении веществ путем перераспределения их между двумя несмешиваемыми фазами: твердой неподвижной фазой (сорбент в хроматографической колонке) и подвижной фазой (эллюент). Используемое оборудование: жидкостной хромато-масс-спектрометр Shimadzu LCMS 8060, оснащенный хроматографической колонкой SeQuant ZIC-HILIC (внутренний диаметр – 2,1 мм, длинна – 150 мм, диаметр частиц – 3,5 мкм). Использовались растворители квалификации «для ВЭЖХ»: ацетонитрил, деионизированная вода; трихлоруксусная кислота х.ч.; ацетат аммония х.ч.; ледяная уксусная кислота х.ч.; стандартный образец гистамина гидрохлорида с массовой долей основного вещества 99,30 % (Sigma-Aldrich H7125), стандартный образец гистамина-D4 гидрохлорида с массовой долей основного вещества 98,60 % (TRC Canada TRC-H436502).

Элюирование проводили в градиентном режиме. Детектирование пиков – методом «Регистрации множественных реакций» (MRM) при регистрации положительных ионов. В качестве подвижной фазы Б использовали ацетонитрил.

Согласно требованию ТР ЕАЭ 040/2016 [4] к содержанию гистамина в рыбе и рыбной продукции диапазон по его определению составляет 10,0-200 мг/кг.

Результат исследований.

Исследование осуществляли в форме аналитического (сравнительного) обзора статистических данных по результатам государственного мониторинга пищевой безопасности, проводимого на территории регионов Российской Федерации на показатели качества и безопасности, уделив особое внимание исследованиям проб рыбы и рыбной продукции на количественное присутствие биогенного амина – гистамина. Количество проведенных лабораторных исследований в подведомственных испытательных центрах Россельхознадзора за 2020-2022 гг. по показателям качества и безопасности, а также исследований на гистамин представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты лабораторного мониторинга рыбы и рыбной продукции на показатели качества и безопасности в РФ за 2020-2022 гг.

Период контроля	Количество исследований на качество и безопасность		Доля исследований на гистамин (от общего числа исследований), %	Получено положительных результатов на гистамин
	всего	в том числе на гистамин
2020	52 580	1 075	2,04	3
2021	45 415	908	2,00	-
2022	45 499	601	1,32	-

Всего за период с 2020 по 2022 гг. в испытательных центрах Россельхознадзора в рамках государственного мониторинга было проведено 143 494 исследований рыбы и рыбной продукции на показатели качества и безопасности, в том числе 2584 исследований проведено на количественное содержание гистамина, что составило 1,8 % от общего количества мониторинговых исследований. По результатам мониторинговых лабораторных исследований в испытательных центрах Россельхознадзора в 2020 году был выявлено лишь 3 случая превышения установленных требований к содержанию гистамина в рыбной продукции, что составило 0,3 % от общего количества исследований на гистамин.

Таблица 2 – Результаты собственных лабораторных исследований по содержанию гистамина в исследуемых образцах рыбы и рыбной продукции

№ образца	Наименование образца	Фактическое содержание мг/кг	Норма по ТР/ЕАС 040/2016 мг/кг, не более
1	«Тунец натуральный»	16,5
2	«Тунец натуральный»	менее 10,0
3	«Тунец натуральный»	54,8
4	«Тунец           натуральный рубленный»	18,3
5	«Тунец           натуральный рубленный»	16,1
6	«Тунец           натуральный рубленный»	32,68
7	«Тунец натуральный в масле для салатов»	26,1
8	«Тунец натуральный в масле для салатов»	19,3
9	«Тунец натуральный в масле для салатов»	48,3	100
10	«Скумбрия натуральная в масле»	29,5
11	«Скумбрия натуральная в масле»	32,7
12	«Скумбрия натуральная в масле»	менее 10,0
13	«Скумбрия натуральная в масле»	28,6
14	«Горбуша натуральная»	11,2
15	«Горбуша натуральная»	менее 10,0
16	«Горбуша натуральная»	менее 10,0
17	«Горбуша натуральная»	менее 10,0
18	Сельдь          атлантическая слабосоленая	45,3
19	Сельдь          атлантическая слабосоленая	54,6
20	Сельдь          атлантическая слабосоленая	37,2
21	Скумбрия горячего копчения	102,4
22	Скумбрия горячего копчения	107,5
23	Скумбрия мороженая	26,3
24	Скумбрия мороженая	менее 10,0
25	Скумбрия мороженая	25,8
26	Скумбрия мороженая	16,1
27	Атлантический         лосось мороженый	менее 10,0
28	Атлантический         лосось мороженый	менее 10,0
29	Горбуша мороженая	менее 10,0
30	Горбуша мороженая	менее 10,0	100

Полученные результаты собственных лабораторных исследований по количественному определению содержания гистамина в исследуемых образцах консервированной, копченой и мороженой рыбы методом ВЭЖХ МС/МС в соответствии с авторской методикой ФГБУ «ВНИИЗЖ» [2] представлены в таблице 2.

Образцы рыбы и рыбной продукции, приобретённые в розничных торговых сетях города Москвы и Московской области по результатам выполненных исследований, в целом соответствуют критериям пищевой безопасности гистамина, указанным в ТР ЕАЭС 040/2016 и безопасны для потребителей.

Однако результаты собственных исследований показали, что в двух образцах № 21 и № 22 (скумбрия горячего копчения) количественное содержание гистамина не отвечает требованиям законодательства [1, 4], данная продукция является непригодной для потребления человеком в пищу.

Заключение. Гистамин является одним из ключевых показателей качества и безопасности рыбы и рыбной продукции. На территории Российской Федерации ведется систематический контроль содержания гистамина согласно требованиям ТР ЕАЭС 040/2016 [4]. За период с 2020 по 2022 годы выявлен 1 положительный случай превышения установленных норм гистамина.

Исследования, проведенные на базе ФГБУ «ВНИИЗЖ» с применением методики, разработанной научными сотрудниками и специалистами указанного института [2], выявили методом ВЭЖХ МС/МС превышение содержания гистамина в 2-х из тридцати исследуемых образцов рыбной продукции, приобретенных на потребительском рынке города Москвы и Московской области.

Применение в лабораторной практике современных и селективных методов и методик анализа пищевой продукции значительно повысит эффективность государственного ветеринарного контроля.