Роль интерлейкина-2 и интерлейкина-4 и их рецепторов в иммуноопосредованных механизмах развития аутоиммунного тиреоидита

Проблема аутоиммунного тиреоидита (АИТ) на сегодняшний день является актуальной для современной эндокринологии как в связи с достаточно высоким уровнем заболеваемости среди населения, так и многочисленностью органов и систем, вовлекаемых в патологический процесс в результате потери гормон-продуцирующей функции щитовидной железы (ЩЖ) и снижения в крови уровня тиреоидных гормонов [1, 5]. Кроме того, актуальность изучения проблемы данного аутоиммунного заболевания щитовидной железы обусловлена потребностью в получении новых данных о механизмах формирования и прогрессирования аутореактивных повреждений щитовидной железы с целью совершенствования методов диагностики, прогноза течения заболевания, а также подходов терапевтического воздействия.

Долгое время считалось, что в патогенез аутоиммунного тиреоидита преимущественно вовлечен Th1 тип иммунного ответа с активацией клеточного звена иммунитета и преобладанием продукции цитокинов Th1 профиля (в том числе интерлейкина-2 (IL-2)), которые опосредуют цитотоксическое воздействие иммунокомпетентных клеток на тиреоциты и, в последующем, развитие гипофункции щитовидной железы. Однако исследования последних лет показывают, что при АИТ также реализуют свое действие Th2-лимфоциты, регулирующие гумораль- ные механизмы аутоиммунного процесса (в частности посредством продукции интерлейкина-4 (IL-4)) [5, 8, 10, 13, 15]. На современном этапе изучения данной проблемы становится очевидным, что модель, указывающая на строгую поляризацию иммунного ответа по Th1 пути при АИТ, требует существенного дополнения и расширения.

Целью данного исследования явилась оценка роли IL-2 и IL-4, а также их рецепторов в иммуноопосредован-ных механизмах развития аутоиммунного тиреоидита.

Материал и методы

В работе приведены результаты обследования 22 пациентов (средний возраст – 40±12 лет), в числе которых 17 женщин и 5 мужчин, с установленным на основании “Консенсуса по диагностике и лечению аутоиммунного тиреоидита” (2002) диагнозом хронического аутоиммунного тиреоидита: клинической картины, данных физикального обследования, наличия характерных ультрасонографических признаков, обнаружения в сыворотке больных повышенного титра антитиреоидных антител (антител к тиреопероксидазе и (или) тиреоглобулину), а также при обнаружении вышеуказанных признаков и первичного гипотиреоза (повышенного уровня тиреотропного гормона (ТТГ) в сочетании с нормальной или пониженной концентрацией свободных фракций три-йодтиронина (Т3) и тироксина (Т4)). Группа обследован-

Таблица 1

Содержание субпопуляций лимфоцитов у больных аутоиммунным тиреоидитом (Me(Q1–Q3))

Показатели	Здоровые доноры, n=30	Пациенты с АИТ, n=22
CD3+-лимфоциты            % 106/л CD8+-лимфоциты            % 106/л CD4+-лимфоциты            % 106/л CD16+ CD56low-лимфоциты      % 106/л CD19+-лимфоциты            % 106/л	69,7, (65,94–70,9) 1430, (1110–1630) 24,28, (23,93–29,48) 600, (400–740) 44,3, (36,16–45,55) 810, (590–1000) 17,24, (16,66–18,92) 380, (260–480) 10,78, (8,47–11,62) 240, (180–340)	74,98 (74,27–75,46), р=0,003 1538,59 (1362–2026,23), р>0,05 24,6 (22,83–27,04), р>0,05 468,47 (425,41–696,36), р>0,05 45,29 (43,94–52,43), р=0,037 909,88 (880,30–1304,71), р=0,048 9,96 (8,34–11,1), р=0,001 175,45 (109,56–229,03), р=0,001 14,89 (12,38–15,52), р=0,027 311,46 (268,91–345,55), р=0,022

Примечание: p – статистическая значимость различий показателя по сравнению с аналогичным показателем в группе здоровых доноров; n – количество обследованных лиц.

ных лиц была сформирована из пациентов в фазе медикаментозного эутиреоза, достигнутой путем приема L-тироксина.

Определение концентраций IL-2, IL-4 в супернатантах интактных и ФГА-стимулированных клеточных культур проводили с использованием твердофазного имму-ноферментного анализа по инструкциям, предлагаемым производителем тест-систем (“ВекторБест”, Россия). Учет результатов иммуноферментного анализа осуществляли с помощью фотометра для микропланшетов “Multiscan EX” (“ThermoLabSystems”, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Количество клеток крови, презентирующих мембранно-связанные рецепторы к IL-2 и IL-4, оценивали методом проточной лазерной цитометрии на цитометре BD FACS Canto^tmll (США) с использованием меченых моноклональных антител (МКАТ) к IL-2R α (CD 25) и IL-4R (CD 124). После культивирования клетки отмывали фосфатным буфером (рН=7,2) и окрашивали стандартными фи-коэритрин-мечеными флуоресцирующими ( λ =585 нм) МКАТ к IL-2R α и IL-4R (“Beckman Coulter”, США).

Содержание лимфоцитов, несущих CD3-, CD4-, CD8-, CD16/CD56low-, CD19-, антигены определяли методом проточной лазерной цитометрии на цитометре BD FACS Cantotmll (США) с использованием меченых флуоресцирующих моноклональных антител BD Multitest 6-color TBNK Reagent (“BD Biosciences”, США).

Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилки. Рассчитывали медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q1–Q3). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался менее 0,05, при межгрупповом сравнении использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Исследование силы взаимосвязей между изучаемыми параметрами осуществляли методом ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Несомненно, активация Т-клеточного звена иммунитета вносит большой вклад в развитие аутоиммунной деструкции ЩЖ при АИТ. Аутореактивные клоны лимфоцитов (в частности Th1-лимфоциты) реализуют эффекторные реакции против собственных клеток и тканей, что в первую очередь отражается на функции ЩЖ [3, 9, 13]. При оценке иммунофенотипических особенностей лимфоцитов крови у больных АИТ нами отмечено повышение количества Т-лимфоцитов (CD3+) по сравнению с контрольными значениями, в частности за счет увеличения абсолютного и относительного содержания Th-лимфоцитов (CD4+); таблица 1.

Дополнительным фактором, отягощающим развитие аутореактивного повреждения ЩЖ, вероятно, является дефицит NK-клеток. Так, в нашем исследовании зафиксировано снижение (относительное и абсолютное) содержания в крови циркулирующих NK-клеток (CD16+CD56low). Предполагается, что данный феномен способствует потере иммунологического контроля над аутореактивными клонами лимфоцитов, их выживанию [11], что во многом определяет активность аутоиммунного воспаления при АИТ. Наряду с этим, активация Т-клеточного звена иммунитета может рассматриваться не только с позиции компонента иммунопатогенеза АИТ, но и как компенсаторный механизм в условиях дефекта неспецифической резистентности, связанной со снижением количества киллерных лимфоцитов.

В то же время Т-клеточная популяция лимфоцитов не является единственной, определяющей развитие АИТ. Большой вклад в развитие заболевания вносят В-клетки, роль которых в патогенезе АИТ состоит в синтезе аутоантител, способных оказывать цитотоксическое действие на фолликулярный эпителий ЩЖ [2, 3]. Результаты нашего исследования указывают на повышение абсолютного и процентного содержания В-лимфоцитов (CD19+) по отношению к значениям в группе здоровых доноров (табл. 1), что подтверждает участие гуморального звена иммунитета в механизмах развития АИТ.

Функции медиаторов активации иммунокомпетентных клеток и межклеточной коммуникации выполняют цитокины. В частности, многогранное влияние на различные этапы иммунного ответа оказывают IL-2 и IL-4 [4, 6]. В результате иммуноферментного исследования концентрации IL-2 и IL-4 как в интактной культуре мононук-леарных лейкоцитов у пациентов с АИТ, так и ФГА-сти-мулированной, не было зарегистрировано отличий относительно значений данных показателей в группе контроля (табл. 2).

По результатам исследования презентации рецепто-

Таблица 2

Концентрация IL-2 и IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и количество комплементарных им рецепторов на лимфоцитах крови у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом (Me(Q1–Q3))

Показатели	Здоровые доноры, n=30	Пациенты с АИТ, n=22
IL-2 (интактная культура клеток), пг/мл IL-2 (ФГА-стимулированная культура клеток), пг/мл CD25+ (интактная культура клеток),% IL-4 (интактная культура клеток), пг/мл IL-4 (ФГА-стимулированная культура клеток), пг/мл CD124+ (интактная культура клеток),%	16,31, (7,78–21,99) 19,16, (7,78–24,84) 23,9, (21,6–37,8) 16,09, (14,92–17,72) 16,56, (15,51–18,07) 4,4, (3,8–4,5)	13,47, (13,47–19,16), р1>0,05 13,47, (7,78–31,95), р1>0,05 р2>0,05 37,2, (31,1–54,8), р1=0,027 , 16,56, (15,85–16,79), р1>0,05 16,56, (15,04–18,77), р1>0,05 р2>0,05 38,2, (11,4–66,0), р1=0,001 ,

Примечание: р1– статистическая значимость различий показателя по сравнению с аналогичным показателем в группе здоровых доноров; р2 – статистическая значимость различий показателя по сравнению с аналогичным показателем в интактной культуре у пациентов с АИТ; n – количество обследованных лиц.

ра к IL-2 лимфоцитам у пациентов с АИТ количество CD25+-лимфоцитов оказалось статистически значимо выше относительно числа данных клеток в контрольной группе (табл. 2). IL-2 играет существенную роль в патогенезе АИТ и проявляет себя как аутокринный ростовой фактор иммунных клеток (в частности, активатор пролиферации и дифференцировки Т-, В-лимфоцитов), индуктор функциональной активации лимфоцитов и моноцитов [6, 7]. С этими данными соотносится наблюдаемое в нашем исследовании повышение числа Th-лимфоцитов (CD4+) и В-клеток (CD19+) у пациентов с АИТ.

Основным эффектом взаимодействия IL-4 с комплементарным ему рецептором и последующей трансдукции сигнала в мононуклеарных лейкоцитах крови является стимуляция гуморального звена иммунитета [6, 14]. Количество лимфоцитов, презентирующих CD124, оказалось практически в 9 раз выше в группе больных АИТ по сравнению с контрольными значениями (табл. 2). Исследование выявило сильную отрицательную корреляционную связь (R=–0,68, p=0,023) между ФГА-стимулирован-ной продукцией IL-4 и количеством CD124+-лимфоцитов. Учитывая отсутствие статистически значимых различий между концентрацией IL-4 в интактной и стимулированной культуре мононуклеарных лейкоцитов при АИТ (табл. 2), можно предположить наличие снижения функционального резерва Т-лимфоцитов, связанного с продолжительной вовлеченностью данной субпопуляции клеток в иммунные реакции при АИТ.

В спектр иммунных функций IL-4, помимо стимуляции антителообразования, входит и противовоспалительное действие в результате депрессии транскрипции генов и усиления деградации мРНК-цитокинов с провос-палительными свойствами. Также некоторыми исследованиями показано стимулирующее влияние IL-4 на пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo [12]. В связи с вышесказанным, увеличение количества CD124⁺-лимфоцитов при АИТ может расцениваться как фактор, способствующий наработке аутоантител к структурам фолликулярного эпителия, с одной стороны, и как компенсаторный фактор, ограничивающий провоспалитель-ное действие цитокинов Th1-профиля, с другой стороны.

Заключение

Таким образом, настоящее исследование подтвержда- ет данные об участии как IL-2 так и IL-4 (цитокинов Th1/ Th2-типов соответственно) и их рецепторов в механизмах развития аутоиммунного тиреоидита, а также об активации гуморального и клеточного звена иммунитета при данном заболевании. В целом, представленные данные указывают на необходимость изучения участия в патогенезе АИТ продукции и рецепции расширенного спектра цитокинов Th1/Th2-профиля с целью выявления механизмов формирования и прогрессирования заболеваний щитовидной железы аутоиммунного генеза.

Исследования выполнены при поддержке Федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009–2013 годы (ГК № 16.740.11.0636); “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2012 годы” (ГК № 16.512.11.2087).