Роль полиморфизма гена кальсеквестрина в развитии фибрилляции предсердий и синдрома слабости синусового узла

ФП – наиболее распространенная аритмия сердца. Известно, что ФП ассоциируется с пятикратным увеличением риска развития инсульта, трехкратным увеличением сердечной недостаточности, двукратным увеличением деменции и смертности [1–3]. ФП – сложное нарушение ритма сердца, которое требует междисциплинарного подхода. В течение длительного времени фармакотерапия была единственным способом лечения ФП. Не так давно были предложены и стали активно развиваться хирургические и интервенционные способы лечения. Несмотря на значительные успехи данных методов, далеко не всегда можно добиться желаемого эффекта.

Достаточно часто в клинической практике наблюдается сочетание ФП и СССУ [4], в основе которого лежит снижение способности синусового узла (СУ) выполнять задачи доминантного пейсмейкера или различные варианты нарушения проведения импульса [5, 6].

Распространенность дисфункции СУ в общей популяции неизвестна. Согласно имеющейся информации, у кардиологических больных она составляет приблизительно 3:5000. Признаки заболевания СУ отмечаются у 6,3–24% больных, в связи с чем они нуждаются в имплантации водителя ритма. Считается, что нарушения функции СУ одинаково часто встречаются у мужчин и жен- щин. С возрастом частота возникновения СССУ увеличивается.

Органическое происхождение заболевания проводящей системы сердца требует как можно более раннего выявления больных и своевременной хирургической коррекции с целью предотвращения внезапной смерти.

В подавляющем большинстве случаев СССУ является приобретенным и лишь в редких случаях – врожденным заболеванием. В его основе лежат дегенеративные изменения в синусно-предсердной области, обусловленные многими причинами (ИБС, артериальная гипертония, кардиомиопатии, гемохроматоз, метастазы опухолей, коллагенозы, инфекционные и инфекционно-аллергические заболевания, амилоидоз сердца, токсические поражения, операции на сердце).

В некоторых случаях не удается выявить причину возникновения как СССУ, так и ФП, в связи с чем необходимо более глубокое изучение молекулярно-клеточных механизмов, регуляции гомеостаза ионов.

Ключевым фактором в понимании природы ФП и СССУ может стать полиморфизм генов, кодирующих белки ионных каналов. Мутации в этих генах могут приводить к нарушению гомеостаза ионов в миокарде. Одним из наиболее важных ионов в клетках сердца является ион кальция – Са2+. Подавляющее большинство клеток, в том числе и кардиомиоциты, имеют специальные системы, которые в покое поддерживают внутриклеточную концентрацию Са2+ на низком уровне и обеспечивают его быстрое удаление после прекращения действия внешнего сигнала, системы, которые в ответ на этот сигнал обеспечивают вход Са2+ в клетку из окружающей среды или его освобождение из внутриклеточных источников, а также те, которые отвечают на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ изменением своей функциональной активности. Первые два типа систем представлены мембранными белками – Са2+-каналами и Са2+-насосами. Последняя подразумевает существование в цитоплазме специальных белков, которые при связывании Са2+ изменяют свою активность, регулируют различные внутриклеточные процессы. В настоящее время такие системы хорошо известны, причем, несмотря на огромное разнообразие клеток и выполняемых ими функций, они достаточно универсальны и имеют много общих свойств. Основным депо и регулятором внутриклеточного транспорта Са2+ в кардиомиоцитах является саркоплазматический ретикулум (СР) [7]. Транспортирующие системы СР осуществляют связывание и перенос этого иона. Так, Са2+-АТФ-аза СР участвует в процессах обратного захвата ионов Са2+. Белок – кальсеквестрин обеспечивает связывание Са2+ внутри СР, а рианодиновые рецепторы осуществляют их освобождение. Осцилляции Са2+ внутри клетки играют определяющую роль в процессах электромеханического сопряжения кардиомиоцитов и, соответственно, сократительной активности сердца [8].

Выявлен ряд мутаций гена кальсеквестрина CASQ2, также определяющих развитие желудочковой тахикардии; хотя они описаны в небольшом количестве семей и их доля в общей структуре заболевания неизвестна [9]. Существуют варианты, связанные с семейной аритмоген-ной дисплазией правого желудочка. В литературе представлено мало информации о роли однонуклеотидных полиморфизмов гена CASQ2 в развитии сердечно-сосудистой патологии. Тем не менее, описаны полиморфные варианты, связанные с аритмией, внезапной сердечной смертью и развитием сердечной недостаточности (СН) у больных ИБС [10].

В последнее время в литературе довольно часто стали появляться результаты исследований, проведенных на лабораторных животных, которые показывают связь полиморфизма генов кальцийтранспортирующих белков, в том числе кальсеквестрина, рианодиновых рецепторов, с развитием нарушений ритма сердца. По данным авторов этих исследований, с дисфункцией систем могут быть связаны задержка потенциала действия в синоатриальном узле с развитием брадикардии, возникновение эктопической и re-entry активности с развитием ФП [11].

Материал и методы

В исследование включено 47 пациентов, средний возраст – 67,0±12,4 лет; из них 38 мужчин 38 (80,8%), с ФП – 15 (31,9%), СССУ – 11 (23,4%) и их сочетанием – 21 (44,6%). В исследуемую группу вошли пациенты с ИБС – 27 (57,4%), гипертонической болезнью – 10 (21,2%), миокардитом – 3 (6,4%), идиопатическим нарушением ритма сердца – 7 (14,9%). Пациенты разделены на 3 группы: первая – пациенты с наличием ФП и СССУ, вторая – только с ФП и третья – с СССУ. Пациентам с верифицированным диагнозом СССУ имплантирован электрокардиостимулятор (ЭКС). Всем исследуемым взята кровь из кубитальной вены в пробирку с этилендиаминтетрауксус-ной кислотой (ЭДТА) для последующего проведения генетического анализа. Получены образцы ДНК у 47 пациентов с ФП и СССУ. Выделение ДНК из цельной крови осуществляли с помощью набора реагентов “Wizard Genomic DNA Purification Kit” (“Promega”, USA) по предлагаемому фирмой протоколу. Выполнена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием набора реактивов (ООО “ТестГен”, Россия) и амплификатора T-100 (Bio– Rad).

Используемые праймеры:

– Прямой праймер: CCAGAACTATAAGCTGAATACACCA.

– Обратный праймер:

AATAATAATAAATCATAAAACCCATTTGATTTTTCTTGCACA.

Условия амплификации. Первая денатурация: 95 °C – 2 мин 35 циклов; 94 °C – 10 с; 62 °C – 20 с; 72 °C – 20 с. Последний синтез цепи: 72 °C – 2 мин.

Для определения генотипа производилось последующее расщепление продуктов ПЦР с использованием рес-триктазы CASQ2-rs6684209 (BssT1I, НПО “СибЭнзим”, Россия). Регистрация результатов осуществлялась электрофоретическим методом в 4%-м агарозном геле на основе однократного трис-боратного буфера с добавлением бромистого этидия. В своей работе мы использовали электрофоретические камеры и гель-документирующую систему Bio-Rad Gel Doc 2000TM производства фирмы “Bio–Rad” (USA).

После обработки рестриктазой получаются следующие продукты:

– Фрагмент длиной 207 п.н. (пар нуклеотидов) – генотип C/C.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов рестрикции гена кальсеквестрина (CASQ2), указывающая на длину полученных фрагментов, что демонстрирует генотип C/C. Сверху цифрами указаны номера проб, сбоку – количество пар нуклеотидов

– Фрагменты длиной 182 и 25 п.н. – генотип T/T.

– Фрагменты длиной 207, 182 и 25 п.н. – генотип C/T.

Результаты и обсуждение

Выполнен анализ полиморфизма rs6684209 гена кальсеквестрина CASQ2 у 47 пациентов методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), рисунок 1.

Всего 35 пациентов имели генотип С/С и 12 – генотип С/Т. У первой группы пациентов выявлен генотип C/C полиморфизма rs6684209 гена CASQ2 у 16, генотип С/Т – у 5. У второй группы пациентов обнаружен генотип С/С гена CASQ2 в 13 случаях, генотип С/Т – в 2. В третьей группе 6 пациентов имели гомозиготный генотип и 5 – гетерозиготный (рис. 2).

Частота встречаемости аллеля С в выборке пациентов с сочетанием ФП и СССУ – 88%, аллеля Т – 12%, в группе с ФП аллель С – 93%, аллель Т – 7%, в группе с СССУ аллель С – 77%, аллель Т – 23%.

Результаты статистической обработки полученных данных представлены в таблице. В нашем исследовании распределение генотипов гена CASQ2 в обследованных группах соответствовало равновесию Харди–Вейнберга. Частота встречаемости генотипов и аллелей в исследовании оказалась сопоставима с данными, полученными в европейской популяции (рис. 3).

Анализ распределения частот генотипов полиморфизма С/Т гена CASQ2 и аллелей не показал наличия статистически значимых различий между исследуемыми группами ( χ ²=0,91, р=0,63; χ ²=1,7, р=0,42).

Для оценки взаимосвязи носительства того или иного аллеля гена CASQ2 с развитием ФП и СССУ рассчитана величина показателя OR (Odds Ratio – отношение шансов). С учетом полученных данных положительной ассоциации между изучаемым фактором и развитием патологического состояния не выявлено.

Полученные результаты у небольшой группы пациентов не выявили связи полиморфизма гена CASQ2 с та-

Рис. 2. Распространенность генотипов С/С и С/Т у пациентов разных групп, где слева по оси представлено количество пациентов: С/С и С/Т – генотипы CASQ2.

Таблица

Распределение частот генотипов CASQ2 и аллелей в группах исследования

Группы	Генотипы		Аллель
	С/С (%)	С/Т (%)	С (%)	Т (%)
ФП и СССУ (n=21)	76,2	23,8	88,0	12,0
ФП (n=15)	86,7	13,3	93,0	7,0
СССУ (n=11)	55,0	45,0	77,0	23,0
p	р1=0,63		р2=0,42

Примечание: С и Т – аллели гена CASQ2, – значимость различий в распределении генотипов и аллелей между исследуемыми группами (р1 и p2 соответственно).

кими заболеваниями, как ФП и СССУ. По данным литературных источников, мутация CASQ2 встречается в 1–2% случаев у пациентов с полиморфной желудочковой тахикардией. Распространенность мутации у пациентов с другими нарушениями ритма сердца неизвестна.

EUR

C|C: 0.694(349)C|T: 0.280(141)

Рис. 3. Частота встречаемости генотипов и аллелей в европейской популяции, где С и Т – аллели гена CASQ2

Выводы

Связи развития ФП и СССУ с генетическим полиморфизмом белка кальсеквестрина в исследуемой выборке не выявлено.