Роль реакции иммунодиффузии с о-полисахаридным антигеном в поствакцинальной диагностике бруцеллеза

Смена двадцатилетнего периода использования в специфической профилактике бруцеллеза агглютиногенного штамма В. аbortus 19 на слабоагглютиногенный В. аbor-tus 82 сыграла исключительную роль в оздоровлении от бруцеллеза крупного рогатого скота в Российской Федерации. Во многом этому способствовала появившаяся возможность ранней поствакцинальной диагностики бруцеллеза в фазе достаточного выраженного иммунитета (не менее 50% иммунных).

Однако при проведении оздоровительных мероприятий возникла проблема, связанная с экономическим ущербом от убоя здоровых животных, реагирующих на вакцину. Это потребовало совершенствования методов дифференциальной диагностики бруцеллеза.

Санитарными и ветеринарными правилами (1996) была предусмотрена дифференциация больного и вакцинированного скота путем постановки реакции иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном.

Несмотря на официальное признание этого метода, многие вопросы, связанные с практическим его применением в разных эпизоотических условиях, требовали от ученых некоторого осмысления и более глубокого изучения.

Впервые R. Diaz, P. Garatea, L.M. Jones, J. Moriyon (1979) [1] был выделен полиВ антиген, с его помощью появилась возможность дифференцировать животных, реагирующих на вакцину из штамма 19, от реагирующих на естественное заражение.

J.W. Chernogrodzky, K.H. Nielsen (1988) [2] из B. аbortus 1119-3 выделен О-полисахаридный антиген, который функционально не отличался от поли-В антигена и мог быть использован для дифференциации вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Другими исследователями В.М. Чекишевым, Ш.Р. Файзрахмановым и др. (1991) [3] с помощью мягкого гидролиза и очистки бактериальной массы штамма B. abortus 19 был получен О-ПС антиген, апробировали его в РИД в геле агара. Установлено, что РИД с О-ПС антигеном была отрицательной во всех случаях с сывороткой крови вакцинированных (штаммы 19, 82 и 104 М) животных через 1,5 мес. и далее после иммунизации [4].

Понять сущность такого феномена можно при более детальном рассмотрении химической структуры грамотрицательной микрофлоры вообще, бруцелл в частности. Клеточные стенки бруцелл представлены гидрофобными макромолекулами липополисахаридов, содержащих специфические О-полисахариды, связанные с ядерной коровой частью и липидом А гетерополисахаридами. О-полисахарид, отщепленный с помощью мягкого кислотного гидролиза от коровой части и липида А, оказался разным по молекулярной массе у слабовирулентных и вирулентных штаммов бруцелл. У вакцинированных штаммов бруцелл О-ПС из-за низкой массы (около 10 КДН) ведет себя как гаптен. Однако исследователи и авторы предложенного антигена указывают на его недостатки, связанные с тем, что при введении вакцины из шт. B. abortus (19 и 82) в больших дозах или при использовании адъювантов положительные показатели РИД с О-ПС антигеном у отдельных животных могут регистрироваться через 1,5–2 мес. после иммунизации. Однако при использовании предусмотренных инструкцией по борьбе с бруцеллезом доз вакцин это не имеет практического значения [5; 8].

Известно, что Brucella abortus экспрессирует преимущественно наработку А антигена, а Brucella melitensis – М антигена, однако у различий количественный, а не качественный характер. Исключение составляют бруцеллы в стабильной R-форме (B. ovis), которые не экспрессируют синтез О-полисахаридов (О-ПС), хотя бруцеллы других видов в R-форме определенное количество О-ПС синтезируют [5]. П.А. Верши-лова (1972) [6] отмечает «…отсутствие в клетках Br. ovis липополисахаридного эндотоксина, характерного для S-форм бруцелл. В ряде серологических тестов: реакции агглютинации с адсорбированными сыворотками, реакции пассивной гемагглютинации, а также преципитации в геле, было установлено сходство Br. ovis и R-форм B. melitensis , а также небольшое антигенное родство с S-формой B. melitensis ».

Анализируя литературные данные, отметим: для диагностики было взято основное свойство предложенного антигена, связанное с тем, что вирулентные (эпизоотические) и слабовирулентные (вакцинные) бруцеллы отличаются по иммунохимической структуре. Дифференцирующим эпитопом является О-цепь полисахарида S-форм бру-целл (О-ПС), присущая высокой молекулярной массе вирулентных штаммов, на которую в организме вырабатываются адекватные антитела. У слабовирулентных и диссоциированных форм бруцелл этот антиген отсутствует [7].

Улучшение эпизоотической ситуации по бруцеллезу в стране ведет к пересмотру системы борьбы с ним, в частности, к необходимости снижения жесткого антигенного прессинга с использованием живых вакцин, с заменой их на менее реактогенные – убитые.

Объекты и методы

Объектом исследования являлся крупный рогатый скот разных половозрастных групп (коровы, нетели, телки) с различным иммунологическим (невакцинированные, многократно иммунизированные вакциной из штамма Brucella abortus 82, химической вакциной) эпизоотологическим (благополучные, угрожаемые, неблагополучные) фоном. В качестве методов серологической диагностики использовали в разные сроки РА, РСК, РИД с О-ПС антигеном.

Результаты исследований

Стада, благополучные по бруцеллезу, реиммунизированные вакциной из шт. B. abortus 82. Известно, что на фоне применения противобруцеллезных вакцин, в т.ч. и вакцины из шт. B. аbortus 82, некоторые здоровые животные длительно реагируют в РА и РСК в низких титрах. В связи с этим, для проверки истинной эпизоотической ситуации в таких стадах нами было рекомендовано исследовать сыворотку крови в РИД с О-ПС антигеном в короткий срок после ревакцинации (2 мес.). При проверке 10324 проб сыворотки крови от коров этим методом не было выделено ни одного положительно реагирующего животного, что подтвердило благополучие хозяйств по бруцеллезу.

Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные вакциной из шт. B. abortus 82, находившиеся в угрожаемой по бруцеллезу зоне . На официально благополучных фермах общественного скота, находившихся в угрожаемой зоне, при исследовании 20601 пробы сыворотки крови через 8–12 мес. после иммунизации вакциной из шт. 82 было выделено 557 (2,7%) животных, реагирующих положительно в РИД. В то же время в личных подворьях на этой же угрожаемой территории у неиммунного поголовья крупного рогатого скота при исследовании 1436 проб на бруцеллез положительные реакции одновременно по 3 тестам (РА + РСК + РИД) были зарегистрированы у 102 коров. РА у 191 и РСК у 161 животного, что свидетельствует о наличии бруцеллезной инфекции, затяжного характера и низкой чувствительности РИД с О-ПС-антигеном.

Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные химической вакциной трехкратно – схема № 1; иммунизированные однократно химической вакциной по фону вакцины из шт. 82 – схема № 2.

Введение химической противобруцеллезной вакцины по схеме 1 стимулирует выработку агглютининов отдельными животными в разных титрах. Так, в пробирочной РА на 21-е сут антитела выявлены у 61,6% животных. У 5,5% коров титры РА были 200 МЕ и выше, которые угасли к 4 мес. Комплементсвязывающие вещества, улавливаемые в РСК на 21-е сут – составляли 11,7%, (в основном 1 : 5), которые также угасли к 4 мес. Сочетанное применение живой вакцины из шт. 82 на телках двукратно с после- дующей реиммунизацией химической противобруцеллезной вакциной стимулировало выработку агглютининов, улавливаемых в РА на 21-е сут у 58,0% при отсутствии реагирующих РА 200 МЕ и выше. Через 1,5 мес. в РА регистрируется увеличение титров агглютининов – РА 200 МЕ – 2,7% с угасанием к 3–4 мес. Комплементсвязывающие вещества, улавливаемые в РСК, регистрировали на 21-е сут в 47,2% (в титрах – 1 : 10 – 6,2%), через 1,5 мес. 11,0% (в титрах 1 : 10–0,7%) и угасают к 4 мес. –11,4% (только 1 : 5). Не были выявлены антитела, регистрируемые в РИД с сывороткой крови и КР с молоком (табл. 1).

Таблица 1

Показатели РИД с О-ПС антигеном на бруцеллез в близкие сроки после реиммунизации ХВ и сочетанного использования вакцины из шт. 82 и ХВ в благополучных по бруцеллезу стадах

Эпизоотическая ситуация	Иммунный фон	Сроки после реиммунизации	Кол-во проб	Результаты исследований (количество реагирующих, %)
				РА МЕ, %		РСК, титры		РИД положительная
				50/100	200	1 : 5	1 : 10
Благополучные	Схема № 1 ХВ + ХВ + ХВ ежегодно	21 сут	162	56,1	5,5	11,7	–	0
		1,5 мес.	274	23,4	4,1	12,7	–	0
		2 мес.	481	22,8	–	1,8	–	0
		4 мес.	393	22,1	0,2	2,5	–	0
	Схема № 2 82 + 82 + ХВ ежегодно	21 сут	239	58,0	–	41,0	6,2	0
		1,5 мес.	145	42,3	2,7	10,3	0,7	0
		3,5 мес.	140	29,4	–	11,4	–	0
			1834

Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные химической вакциной, находившиеся в угрожаемой по бруцеллезу зоне.

При проведении фоновых исследований сыворотки крови от всех возрастных групп крупного рогатого скота: телят, телок, нетелей и коров 3 гуртов был получен результат: перед иммунизацией (в отдаленные сроки – 7 мес.) выявлено: в РА – 50 МЕ – 8,2%; 100 МЕ – 4,8%; 200 МЕ – 0,7%; 400 МЕ – 1,0% реагирующего на бруцеллеза скота. РСК 1/5 – 10,3%; 1 : 10 – 3,0%; 1 : 20 – 2,4%; 1 : 20 – 2,4 процента. В то время как в РИД с О-ПС антигеном только 1,0% больного скота. Данные свидетельствуют, что показатели РИД с О-ПС-антигеном не отражают объективную ситуацию по бруцеллезу и отстают по чувствительности от показателей реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.

Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (коровы). В близкие после использования химической вакцины сроки исследовано 1237 проб сыворотки крови и максимальное выделение больного скота зарегистрировано через 14 сут – 12 гол (4,4%), через 21 сут – 9 гол (2,7%) (табл. 2).

Таблица 2

Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (коровы)

Группа	Количество	Срок исследования	Результаты серологических реакций в %
			РИД	РА МЕ			РСК титры
				50	100	200	5	10	20
Коровы	291	7 мес.	1,0	8,2	4,8	0,7/1,0	10,3	3,0	2,4/2,4
Иммунизация ХВ 28.04.11 г.
Коровы	86	7 сут	0	8,1	5,8	1,1	17,4	3,4	0
Коровы	267	14 сут	4,4	21,7	38,5	17,2/1,1	25,0	11,9	8,6/1,4
Коровы	332	21 сут	2,7	24,3	2,2	28,3/2,4	14,7	6,9	4,5/0,6
К + т	499	1,5–2 мес.	0,8	17,4	9,8	0	5,8	1,8	0,6
Коровы	344	4–5 мес.	0,5	18,3	6,9	0	1,5	4,0	0

Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (телок). В отдаленные сроки (7–8 мес.) после иммунизации исследовано 218 гол и выявлено 3 гол (2,8%). В короткие сроки исследования не проводили; первое исследование – через 3 мес. после иммунизации ХВ, установлено 12 (11,4%) больных телок перед осеменением. Через 4 мес. еще зарегистрированы животные, реагирующие в РИД – 2,0%.

Закл ючение

Проведенные исследования по изучению диагностической эффективности О-по-лисахаридного антигена в стадах, многократно иммунизированных живой противо-бруцеллезной вакциной из шт. B. abortus 82 и химической противобруцеллезной вакциной, с учетом различного иммунного фона (благополучные и неблагополучные) позволили заключить следующее.

Через 2 мес. после многократной реиммунизации вакциной из шт. B. abortus 82 у коров в благополучных по бруцеллезу стадах положительные показатели РИД с О-ПС антигеном не зарегистрированы.

В благополучных по бруцеллезу стадах, трехкратно реиммунизированных химической вакциной по фону вакцины из шт. 82, в последующем не зарегистрирован синтез антител, улавливаемых РИД, начиная с 21 -х сут.

Положительные показатели РИД с О-ПС антигеном совпадают с высокими титрами РА и РСК, но дополнительно не выявляют реагирующих животных и по чувствительности отстают от показателей РА и РСК в отдельности.

В оздоравливаемых стадах РИД эффективна только в близкие сроки (1–3 мес.) после вакцинации (шт. 82, химическая вакцина) на фоне достаточно высокого иммунитета по стаду после провокации скрытого течения бруцеллеза. В отдаленные сроки (6–12 мес.) при выявлении больных бруцеллезом животных достаточно пользоваться результатами РА и РСК как более чувствительных методов.

A.A. Novitsky, W.I. Okolelov

Role of reaction of the immunodiffusion with O-polisaharidnym the antigen in postvaccinal diagnostics brucellosis