Роль сероводорода и монооксида углерода в коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов пациентов с ишемической болезнью сердца

УДК 616.12-005.4:616.155.2:616.151.4:546.221.1

Беляева С.Н., Трубачева О.А. Роль сероводорода и монооксида углерода в коллаген-ин-дуцированной агрегации тромбоцитов пациентов с ишемической болезнью сердца. Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. 2020;35(3):86–92.

Главными факторами, с которыми инициируется развитие атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС), может быть дисфункция либо повреждение эндотелия, аккумуляция в сосудистой стенке холестерина [1]. Окисленные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) обладают высокой токсичностью, вызывая апоптоз сосудистых клеток. Гиперлипидемия имеет прямое отношение к образованию гиперактивных тромбоцитов [2]. Известно, что в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в частности ИБС, немаловажную роль играет нарушение структурно-функционального статуса тромбоцитов: активация кровяных пластинок способствует развитию внутрисосудистого тромбообразования. Показано, что при активации происходит увеличение среднего объема тромбоцитов [3], наблюдается повышенная чувствительность к агонистам, увеличение в цитозоле свободного кальция, повышение продукции эндогенных активных форм кислорода. Это приводит к усилению функциональной активности тромбоцитов и способности к агрегации. Применение ингибиторов агрегации тромбоцитов как основных средств выбора для профилактики тромбоза всегда сопряжено с повышенным риском кровотечений. Поэтому возникает необходимость не только выяснения фундаментальных основ их активации и вклада в прогрессирование сердечно-сосудистой патологии, но и разработки наиболее оптимальных подходов к коррекции возникших нарушений. Претендентами на эту роль в последнее время рассматриваются эндогенно синтезируемые газовые молекулы – сероводород (H2S) и монооксид углерода (CO). Известно, что главным источником СО служит эндотелий [4, 5], в то время как S продуцируется в основном гладкими мышцами, адипоцитами и эритроцитами [6]. Несмотря на хорошо известные токсические свойства СО и S, в отечественной и мировой литературе существует достаточно сведений о сигнальной функции этих молекул [7]. На сегодняшний день имеются данные, что H2S и СО принимают участие в регуляции функциональной активности различных органов и систем организма человека [8]. Согласно ряду данных, СО и H2S рассматриваются как ингибиторы агрегации тромбоцитов, но точно не установлено, через какие внутриклеточные сигнальные пути реализуется их действие.

Цель исследования: изучить влияние доноров H2S и СО на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов здоровых доноров и пациентов с ИБС.

Материал и методы

Проведено одномоментное исследование, в ходе выполнения которого обследованы 37 человек. В контрольную группу вошли 13 здоровых доноров в возрасте от 45 до 60 лет. Группу пациентов с ИБС составили 24 человека в возрасте от 41 до 75 лет. Все обследованные пациенты получали регулярную комбинированную базисную терапию в соответствии с современными рекомендациями для лечения ИБС. Критериями исключения из исследования являлись острые сосудистые осложнения давностью менее 6 мес., тяжелая сопутствующая патология, клинические и лабораторные признаки острого воспаления, отказ от участия в исследовании. Для получения тромбоцитов использовали периферическую венозную кровь, забираемую из локтевой вены утром, натощак в вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт (цитрат натрия 3,8%) в соотношении: одна часть антикоагулянта на девять частей крови. Кровь тщательно перемешивали с антикоагулянтом путем плавного покачивания, затем подвергали центрифугированию при 1500 об./мин в течение 7 мин. Отбирали надосадочный слой – богатую тромбоцитами плазму. Агрегационную активность изолированных тромбоцитов исследовали с помощью метода Г. Борна (1962) в модификации З.А. Габбасова (1989) на двухканальном лазерном анализаторе (220 LA «НПФ Биола», Россия). Метод основан на анализе флуктуаций светопропускания (ФСП-метод), вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале. Относительная дисперсия таких флуктуаций пропорциональна среднему размеру агрегатов и используется для исследования кинетики агрегации. Метод отличается высокой чувствительностью, что делает его пригодным для исследования спонтанной агрегации, агрегации под действием низких концентраций индукторов, а также агрегации субклеточных частиц и макромолекул. В качестве маркеров функциональной активности тромбоцитов определяли степень и скорость агрегации богатой тромбоцитами плазмы по кривым светопропускания и среднего размера агрегатов. Наиболее информативным показателем кол-лаген-индуцированной агрегации тромбоцитов является степень агрегации по кривой светопропускания. Для индукции агрегации использовали коллаген в конечной концентрации 2 мг/мл.

В настоящем исследовании в качестве донора сероводорода использовали гидросульфид натрия (NaHS). В водном растворе NaHS диссоциирует до ионов Na⁺ и HS-. Последний в свою очередь взаимодействует с Н⁺ с формированием H₂S. В качестве донора CO использовали CORM–2. Тромбоциты инкубировали с данными модификаторами в течение 30 мин при 37 °С. Анализ показателей проводили при помощи программы SPSS STATISTICS 17.0. Фактические данные представлены в виде Me ( Q ₁– Q ₃). При сравнении независимых выборок использовали U-критерий Манна – Уитни, а для зависимых выборок Т-критерий Вилкоксона с поправкой Бон-феррони. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что у пациентов с ИБС при использовании всех концентраций донора H2S статистически значимо снижалась коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов по кривой светопропускания при концентрации 10-5 М. По кривой среднего размера агрегатов происходило значимое снижение агрегации при добавлении донора H2S в концентрациях 10-5 M, 10-6 M. При значениях концентрации донора H2S 10-4, 10-5, 10-6 М скорость агрегации тромбоцитов статистически значимо снижалась по кривой среднего размера агрегатов у пациентов с ИБС (табл. 1, рис. 1).

У здоровых доноров происходило значимое снижение агрегационной активности по кривой светопропускания во всем диапазоне концентраций донора H2S (10–4–10–6 М). Скорость агрегации по кривой светопропускания статистически значимо уменьшалась при действии донора H2S в концентрации 10–6 М. При значении концентрации донора H2S 10–4 М статистически значимо снижалась агрегация по кривой среднего размера агрегатов.

Скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов статистически значимо уменьшалась при концентрациях 10–5 и 10–6 М (табл. 2, см. рис. 1).

в

з 1 s

Коллаген, 1 мг/мл

Collagen, 2 ng/ml

Коллаген + 10–4 M NaHS

Collagen + 10–4 M NaHS

Коллаген + 10–5 M NaHS

Collagen + 10–5 M NaHS

Коллаген + 10–6 M NaHS

Collagen + 10–6 M NaHS

• ■    пациенты с ИБС / patients with coronary heart disease

• ■    здоровые доноры / healthy donors

Рис. 1. Влияние донора сероводорода на агрегацию тромбоцитов здоровых доноров и пациентов с ишемической болезнью сердца по кривой светопропускания (%)

Fig 1. The effects of hydrogen sulfide donor on platelet aggregation based to the light transmission curve (%) in healthy donors and patients with coronary heart disease.

Примечание: * – р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers.

Таблица 1. Влияние донора сероводорода на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов пациентов с ишемической болезнью сердца Table 1. The effect of hydrogen sulfide donor on collagen-induced platelet aggregation in patients with coronary heart disease

Показатели Parameters	Коллаген, 2 нг/мл Collagen, 2 ng/mL (n = 24)	Коллаген +10-4 M NaHS Collagen + 10-4 M NaHS ( n = 24)	Коллаген +10-5 M NaHS Collagen + 10-5M NaHS (n = 24)	Коллаген +10-6 M NaHS Collagen +10-6M NaHS ( n = 24)
I	2,8 (2,34,2)	2,6 (2,2–4,2)	2,5* (2,1–3,3)	2,5* (1,8–3,4)
II	7,8 (2,46,4)	5,4 (2,9–6,9)	3,8* (2,4–5,4)	5,7 (3,6–7,0)
III	4,1 (3,28,2)	3,33* (1,6–4,8)	3,8* (1,1–5,3)	3,0* (0,7–5,3)
IV	11,9 (8,816,3)	12,7 (9,5–16,4)	12,5 (9,7–16,5)	15,4 (10,6–20,4)

Примечание: * р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов;

I – степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед.;

II – степень агрегации по кривой светопропускания, %;

III – скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед./мин;

IV – скорость агрегации по кривой светопропускания, %/мин.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers;

I – degree of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units;

II – degree of platelet aggregation based on the light transmission curve, %;

III – speed of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units/min;

IV – speed of platelet aggregation based on the light transmission curve, %/min.

Таблица 2. Влияние донора сероводорода на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов здоровых доноров

Table 2. The effect of hydrogen sulfide donor on collagen-induced platelet aggregation in healthy donors

Показатели Parameters	Коллаген,2 нг/мл Collagen, 2 ng/mL (n = 13)	Коллаген +10-4 M NaHS Collagen + 10-4M NaHS ( n = 13)	Коллаген + 10-5 M NaHS Collagen + 10-5M NaHS ( n = 13)	Коллаген + 10-6 M NaHS Collagen + 10-6M NaHS ( n = 13)
	2,2	1,9*	2,0	2,03
I	(2,02,8)	(1,52,0)	(1,8–2,8)	(1,72,4)
II	11,0	3,6*	3,43*	2,9*
	(5,950,2)	(2,5–5,2)	(2,8–6,1)	(2,03,9)
III	3,7	1,9	2,6*	2,4*
	(2,44,9)	(0,8–3,1)	(1,9–3,4)	(1,02,7)
IV	18	12,2	13,3	9,8*
	(1437,1)	(10,0–16,5)	(11,1–19,2)	(7,313,2)

Примечание: * – р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов;

I – степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед.;

II – степень агрегации по кривой светопропускания, %;

III – скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед./мин;

IV – скорость агрегации по кривой светопропускания, %/мин.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers;

I – degree of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units;

II – degree of platelet aggregation based on the light transmission curve, %;

III – speed of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units/min;

IV – speed of platelet aggregation based on the light transmission curve, %/min.

У здоровых доноров антиагрегационный эффект донора H2S выражен сильнее по сравнению с группой пациентов с ИБС. Полученные результаты можно объяснить снижением концентрации эндогенного H2S в плазме у больных с сердечно-сосудистой патологией. Как правило, у пациентов с ИБС нарушен липидный обмен, в результате этого происходит дезорганизация фосфолипидного состава мембраны тромбоцитов с нарушением ее проницаемости. Другой причиной антиагрегационного эффекта H2S может быть снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция при сердечно-сосудистой патологии. Для инициации агрегации тромбоцитов необходимо увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция, в некоторых исследованиях показано, что гидросульфид натрия снижает мобилизацию этих ионов, следовательно, тормозятся процессы агрегации [9].

При использовании CORM-2 у пациентов с ИБС наблюдалось значимое снижение агрегационной активно- сти тромбоцитов по кривым среднего размера агрегатов и светопропускания при всех использованных концентрациях от 10-4 М до 10-6 М. Скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов значимо уменьшалась при концентрации CORM-2, равной 10-6 М. При концентрации донора CO 10-4 М скорость агрегации по кривой светопро-пускания статистически значимо снижалась у пациентов с ИБС (табл. 3, рис. 2).

Установлено, что у здоровых доноров происходило снижение степени коллаген-индуцированной агрегационной активности тромбоцитов по кривой среднего размера агрегатов под действием донора СО в концентрации 10-5 М. Снижение агрегационной активности по кривой светопропускания наблюдалось при значении концентрации донора CO 10-4 М. Скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов значимо снижалась при концентрации СО 10-5 М у здоровых доноров (табл. 4, см. рис. 2).

Таблица 3. Влияние СОRM-2 на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов пациентов с ишемической болезнью сердца

Table 3. The effect of CORM-2 on collagen-induced platelet aggregation in patients with coronary heart disease

Показатели Parameters	Коллаген, 2 нг/мл Collagen, 2 ng/mL ( n = 24)	Коллаген + 10-4 M СОRM-2 Collagen + 10-4M СОRM-2 ( n = 24)	Коллаген + 10-5 M СОRM-2 Collagen + 10-5M СОRM-2 ( n = 24)	Коллаген + 10-6 M СОRM-2 Collagen + 10-6M СОRM-2 ( n = 24)
I	2,8 (2,3–4,2)	2,8* (1,7–4,2)	2,9* (2,3–4,2)	2,6* (1,84–4,14)
II	7,8 (2,4–6,4)	6,4* (4,3–15,9)	6,6* (3,64–20,2)	6,6* (4,3–16,0)
III	4,1 (3,2–8,2)	3,8 (1,5–8,2)	4,4 (2,4–6,9)	3,6* (1,9–5,4)
IV	11,9 (8,8–16,3)	15,0* (11,2–23,4)	14,9 (10,3–39,5)	15,4 (10,9–38,5)

Примечание: * р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов;

I степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед.;

II степень агрегации по кривой светопропускания, %;

• III    скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед./мин;

• IV    скорость агрегации по кривой светопропускания, %/мин.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers;

• I    – degree of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units;

• II    – degree of platelet aggregation based on the light transmission curve, %;

• III    – speed of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units/min;

• IV    – speed of platelet aggregation based on the light transmission curve, %/min.

Таблица 4. Влияние СОRM–2 на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов здоровых добровольцев Table 4. The effect of CORM-2 on collagen-induced platelet aggregation in healthy volunteers

Показатели Parameters	Коллаген, 2 нг/мл Collagen, 2 ng/mL (n = 13)	Коллаген + 10-4M СОRM-2 Collagen + 10-4M СОRM-2 ( n = 13)	Коллаген + 10-5M СОRM-2 Collagen + 10-5M СОRM-2 ( n = 13)	Коллаген + 10-6 M СОRM-2 Collagen + 10-6M СОRM-2 ( n = 13)
I	2,1 (1,9–2,8)	2,5 (1,9–2,7)	1,6* (1,4–1,9)	2,4 (1,3–2,4)
II	11,0 (5,9–50,2)	5,19* (4,0–6,4)	6,07 (5,1–9,2)	5,6 (4,0–8,3)
III	3,71 (2,4–4,9)	3,30 (1,2–4,9)	1,52* (0,6–2,8)	2,6 (1,2–3,8)
IV	18 (14,0–37,1)	10,9 (9,4–16,5)	11,7 (10,1–21,5)	10,3 (8,1–15,5)

Примечание: * – р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов;

• I    – степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед.;

• II    – степень агрегации по кривой светопропускания, %;

• III    – скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед./мин;

• IV    – скорость агрегации по кривой светопропускания, %/мин.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers;

• I    – degree of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units;

• II    – degree of platelet aggregation based on the light transmission curve, %;

• III    – speed of platelet aggregation based on the average aggregate size curve, relative units/min;

• IV    –speed of platelet aggregation based on the light transmission curve, %/min.

Коллаген, 1 мг/мл

Collagen, 2 ng/ml

Коллаген + 10–4 M CO

Collagen + 10–4 M NaHS

Коллаген + 10–5 M CO

Collagen + 10–5 M CO

Коллаген + 10–6 M CO

Collagen + 10–6 M CO

■ пациенты с ИБС / patients with coronary heart disease ■ здоровые доноры / healthy donors

Рис. 2. Влияние донора монооксида углерода на агрегацию тромбоцитов здоровых доноров и пациентов с ишемической болезнью сердца по кривой светопропускания (%)

Fig 2. The effects of carbon monoxide donor on platelet aggregation based on the light transmission curve (%) in healthy donors and patients with coronary heart disease

Примечание: * – р < 0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации без модификаторов.

Note: * – p < 0.05 compared to the values of collagen-induced aggregation without modifiers.

При сравнении параметров агрегации между исследуемыми группами статистически значимые различия отмечались при концентрации донора CO 10-5 М. Агрегация уменьшалась у здоровых доноров по кривой среднего размера агрегатов, а также скорость агрегации снижалась по кривой среднего размера агрегатов по сравнению с пациентами с ИБС. Из литературных данных известно, что донор CO блокирует коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов благодаря воздействию на фазу активации фибриногена, как следствие, не образуются фибриновые мостики, и механизм агрегации нарушается [10]. Отсутствие статистически значимых различий в эффектах газотрансмиттеров в исследуемой группе и в группе здоровых доноров может объясняться тем, что пациенты с ИБС находились на антиагрегационной терапии, поэтому подобранные концентрации газотрансмит-теров H2S и CO оказались недостаточно информативными в данных условиях.

Заключение

Донор H2S вызывает снижение коллаген-индуциро-ванной агрегации тромбоцитов по кривой светопропуска-ния как у здоровых доноров, так у и пациентов с ИБС. Коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов по кривой светопропускания снижается под действием донора CO, у здоровых доноров эффект более выражен, чем у пациентов с ИБС. В настоящем исследовании показано, что эффекты газовых трансмиттеров донора H2S и донора CO на коллаген-зависимую агрегацию тромбоцитов однонаправленные у здоровых доноров и пациентов с ИБС.