Роль тромбофилии в развитии тромботических осложнений при новой коронавирусной инфекции

коагулопатии, результатом которой является высокая частота развития венозных тромбоэмболических осложнений (ВТЭО), таких как тромбоз глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК), тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), а также артериальных осложнений, таких, как ишемический инсульт (ИИ) и инфаркт миокарда (ИМ), что ассоциировано с высокой смертностью [4, 5]. Развитие протромботического состояния, сопутствующего заболеванию, является многофакторным процессом, в основе которого лежат реакции воспаления, ассоциированные с эндотелиальной дисфункцией, активацией системы гемостаза, аутоиммунными нарушениями, в том числе с появлением анти-фосфолипидных антител (аФA) [5-7]. В основе патогенеза коагулопатии, связанной с COVID-19, лежит патологическое состояние эндотелия, при котором вирусной инвазией в эндотелиальные клетки запускается каскад провоспалительных и прокоагулянтных реакций. SARS-CoV-2 проникает в клетки через рецептор ангиотензин-превраща-ющего фермента 2, который в большом количестве экспрессируется на эндотелиальных клетках, что приводит к прямому повреждению эндотелия [7, 11]. Нарушение целостности эндотелия способствует активации тромбоцитов, привлечению лейкоцитов и нарушению регуляции высвобождения фактора Виллебранда, что предрасполагает к микрососудистому тромбозу и макрососудистым нарушениям [2, 6, 11]. Кроме того, возникающая воспалительная реакция, характеризующаяся синдромом высвобождения цитокинов, усиливает дисфункцию эндотелия и активацию коагуляции, поддерживая порочный круг тромбовоспаления, что может способствовать тромбообразованию [3, 8]. В связи с вышеперечисленным наличие у пациента с коронавирусной инфекцией врожденного или приобретенного тромбофилического состояния может быть дополнительным фактором риска развития тромбоза.

По происхождению тромбофилии подразде- ляются на наследственные и приобретенные. Характерной особенностью наследственной тромбофилии (НТ) является наличие той или иной генетической мутации, которая влияет на количество и/или функцию белка системы гемостаза. Мутации с потерей функциональной активности белка характерны для естественных антикоагулянтов, к которым относится антитромбин, протеин С и протеин S. Усиление функциональной активности белка характерно для мутации G1691 (Arg506Gln) в гене фактора V (фактор V Leiden) и мутации G20210A в гене фактора II (протромбина). Указанные формы врожденных тромбофилий наследуются как аутосомно-доминантный признак и передаются из поколения в поколение лицами обоего пола [9-13].

В таблице 1 представлены сведения о встречае мости основных форм наследственных тромбофи лий в общей популяции лиц европеоидной расы и среди больных венозными тромбозами . Распро страненность дефицита естественных антикоа гулянтов в общей популяции лиц европеоидной расы и среди больных венозным тромбозом невы сока , немного выше у мутаций фактора V Leiden G1691 А и G20210A в гене протромбина [10-13].

Таблица 1

Частота встречаемости различных форм наследственных тромбофилий в здоровой популяции и при венозном тромбозе

Форма наследственной тромбофилии	Частота встречаемости в общей популяции,%	Частота встречаемости среди больных венозным тромбозом,%
Дефицит антитромбина	0,02-0,2	1,0
Дефицит протеина С	0,2-0,4	3,0
дефицит протеина S	0,03-0,5	1,0-2,0
Мутация фактора V Лейден G1691 (Arg506Gln (гетерозиготное носительство)	3-7	20,0
Мутация гена протромбина (II) G20210A (гетерозиготное носительство)	1 - 4	6,0

Эпидемия новой коронавирусной инфекции привела к многочисленным исследованиям состо яния системы гемостаза и патогенеза развития тромбоза при данном заболевании . По данным различных клинических исследований часто та встречаемости ТГВНК среди госпитализиро ванных больных с коронавирусной инфекцией в среднем составляет 13%, а ТЭЛА – 8% [4, 5]. В клинических исследованиях проводилась оценка связи между наличием у больных COVID-19 мар керов наследственной тромбофилии и риском возникновения тромбоза или / и тяжестью тече ния заболевания . Однако результаты этих иссле дований оказались весьма противоречивыми . Так , А . Kiraz е t al. не выявили различий в частоте встре чаемости мутаций FII (G20210A) и FV (G1691A, FV

Leiden) между группой больных с тяжелой COVID-19-ассоциированной пневмонией и здоровыми лицами [13]. Исследование J.Q. Xie еt al., основанное на изучении группы из 18 818 амбулаторных пациентов с COVID-19, обнаружило почти двукратное увеличение риска ВТЭО в случае носительства мутации FV Leiden. В то же время, для варианта G20210A гена протромбина не было выявлено статистически значимого различия в ЧВ в данной группе больных, имеющих эпизод ВТЭО и без такового [14]. Другое исследование, проведённое de la Morena Barrio еt al., показало, что у большинства пациентов с НТ не было тромботических осложнений [14]. Авторы считают, что причина, по которой гиперкоагуляционные изменения у пациентов с НТ не привели к развитию тромботических эпизо- дов, может быть связана с тем, что эти пациенты уже принимали антикоагулянты до COVID-19 или в начале заболевания [15]. Полученные сведения позволяют сделать вывод о том, что наличие в генотипе пациента маркеров НТ, способных влиять на функциональное состояние гемостаза, не всегда является дополнительным фактором, провоцирующим развитие тромботического эпизода.

По мере изучения наследственных факторов у пациентов с COVID-19 стало очевидно , что пред расположенность к тромбозу может иметь по - лигенный характер и требует проведения ком плексного анализа аллельного полиморфизма генов различных компонентов системы гемоста за . Группой исследователей был выявлен фактор риска развития тромботических осложнений у па циентов с COVID-19 – генотипическое сочетание противовоспалительных цитокинов IL-6 -174 CC / IL-1B -31 ТС , а также наблюдались мутации про - тромбогенных генотипов фактора FXIII (FXIII-A 163 TT) и фибриногена (FI-B -455 AA). Было вы сказано предположение о возможной протектив - ной роли генотипа PAI-1 5G/5G в патогенезе тром боза у пациентов с COVID-19 [16, 17]. Полученные данные свидетельствуют о вероятном влиянии особенностей генетического полиморфизма фак торов плазменного звена гемостаза и некоторых провоспалительных цитокинов на риск разви тия тромботических осложнений у пациентов с COVID-19.

Несмотря на то , что к настоящему времени полностью расшифрована структура генов , коди рующих антитромбин , протеины С и S, основным препятствием к широкому внедрению генетиче ских тестов для скрининга указанных форм на следственной тромбофилии является чрезвы чайно высокая гетерогенность молекулярных повреждений генов системы естественных анти коагулянтов [18-20]. В связи с этим по - прежнему рекомендуется использование функциональных и иммунологических методов , направленных на определение активности и уровня этих белков в крови .

Кроме вероятной роли наследственной предрасположенности в патогенезе тромбозов при COVID-19 имеет значение и приобретенная тромбофилия, в частности, антифосфолипидный синдром (АФС), который характеризуется развитием рецидивирующих тромбозов сосудов любого калибра и типа и обязательным выявлением стойко позитивных аФА. Распространенность АФС составляет от 20 до 50 случаев на 100 тыс. человек (в зависимости от этнического происхождения), а заболеваемость – примерно 5 случаев на 100 тыс. человек в год [21]. Согласно международным рекомендациям Саппоро [25], все аФА можно разделить на критериальные, которые входят в состав лабораторных критериев АФС, и, так называемые, некритериальные антитела. Группа критериальных антител, которые обладают способностью влиять на фосфолипидзависимые коагуляционные тесты, имеет общее название – волчаночный антикоагулянт (ВА). С помощью стандартизованного иммуноферментного анализа (ИФА) также определяются антитела к β2-гликопротеину I (аβ2GPI) и к кардиолипину (аКЛ). Методом ИФА определяются также следующие некритериальные антитела: антифосфатидилсериновые, анти-протромбиновые, антинуклеарные антитела и другие, однако, их связь с повышением риска тромбоза не выявлена [21, 22, 24, 25].

Рядом исследователей было отмечено , что вол чаночный антикоагулянт чаще других аФА по является во время острого периода COVID-19. По данным ряда авторов , ВА выявлялся у 60% – 90% госпитализированных пациентов [25, 26]. Мас штабные наблюдения , подтверждающие частую встречаемость положительных результатов вы явления ВА во время острого периода COVID-19, возможно , связаны с тем , что в большинстве ис следований не учитывались факторы , влияющие на определение ВА . К таким факторам относят ся лечение антикоагулянтами , высокий уровень С - реактивного белка , а также отсутствие повтор ного исследования через 12 недель , согласно Меж дународным рекомендациям [27]. В большинстве выявленных случаев титры ВА были низкими , и они не были связаны с неблагополучными клини ческими исходами . В тех же случаях , когда нали чие ВА проверяли через несколько месяцев после выписки , у подавляющего большинства пациен тов (94%) с ранее выявленным положительным результатом на наличие ВА повторный тест был отрицательным [25, 26].

В связи с вышеизложенным , оценка роли тром бофилии при ВТЭО среди пациентов с COVID-19 представляет научный интерес .

Цель исследования . Оценить роль тромбофи лии в развитии тромботических осложнений при новой коронавирусной инфекции .

Материалы и методы. Обследовано 77 пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию в тяжелой и среднетяжелой форме. Срок после перенесенного заболевания до проводимого обследования составлял от 1 до 4 месяцев. В группу вошли 28 мужчин и 49 женщин в возрасте от 24 до 84 лет, медиана возраста составила 59 лет. В контрольную группу вошли 68 практически здоровых лиц. Более чем у половины пациентов (65%) выявлена значимая сопутствующая патология: гипертоническая болезнь 2–3 ст. (ГБ), ишемическая болезнь сердца (ИБС), атеросклеротический кардиосклероз, ожирение 2-3 степени, сахарный диабет 2-го типа. Наиболее часто при этом встречалась ГБ, причем в большинстве случаев в сочетании с ИБС (у 40 пациентов – 52%). Критериями исключения из исследования явилось присутствие онкологических заболеваний и иммунодефицитных состояний. С целью профилактики больше половины пациентов (56%) принимали на момент обследования прямые пероральные антикоагулянты (ПОАК). Остальные пациенты (44%) находились без антикоагулянтной профилактики, треть из них (29%) принимала антиагрегантные препараты, содержащие ацетилсалициловую кислоту. Суточные дозы ПОАК рассчитывались в зависимости от присутствия или отсутствия тромбоза в анамнезе пациентов: 23 человека получали ривароксабан (5 мг или 2,5 мг в сутки), 16 – апиксабан (5 мг или 2,5 мг в сутки), 4 – дабигатран (150 мг один или 2 раза в сутки) в течение 45 дней. Определение активности антитромбина (АТ), протеина С (РС) и уровня свободного протеина S проводили на автоматическом коагулометре серии ACL (Instrumentation Laboratory, США) с использованием реактивов HemosIL (Instrumentation Laboratory, США) согласно рекомендациям производителя.

Определение ВА проводилось согласно рекомендациям Международного Комитета по тромбозу и гемостазу с помощью функциональных методов, основанных на способности ВА in vitro ингибировать фосфолипидзависимые коагуляционные реакции в плазме, с использованием трехэтапной системы тестирования, состоящей из скринингового, корректирующего и подтверждающего тестов (screen-mix-confirm) [25]. Скрининговые тесты считаются положительными, если нормализованное время свертывания образца плазмы удлинено относительно порогового значения. В таком случае далее проводят корректирующие тесты путем смешивания в соотношении 1:1 с пулом нормальной бедной тромбоцитами донорской плазмы либо с коммерческой нормальной плазмой, аттестованной по нормальному содержанию факторов свертывания. При отсутствии коррекции выполняются подтверждающие тесты. Принцип действия подтверждающих тестов основан на способности истощения (нейтрализации) антикоагулянтного эффекта ВА избытком фосфолипидов. ВА считают положительным, если нормализованное отношение >1,2.

Определение классических детерминантх на следственной тромбофилии – мутаций FV G1691A и FII G20210A – выполнено методом полимераз ной цепной реакции с последующей обработкой амплификата эндонуклеазой рестрикции Hind III и визуализацией полученных результатов в 7% полиакриламидном геле . В качестве материала исследования использовалась геномная ДНК , вы деленная из лейкоцитов крови [29].

Результаты исследования и их обсуждение . По наличию и / или отсутствию протромбогенных мутаций и тромбозов в анамнезе были выделе ны четыре группы пациентов : без мутаций и без тромбоза (1), без мутаций , но с тромбозом (2), с мутациями и с тромбозом (3), с мутацией , но без тромбоза (4), ( таблица 2).

Таблица 2

Распределение пациентов по группам в зависимостиот наличия мутаций FV G1691A и FII G20210A и тромбозов в анамнезе

Без мутаций и без тромбоза, группа 1	Без мутаций, с тромбозом группа 2	С мутациями и с тромбозом группа 3	С мутациями, без тромбоза группа 4
n = 61 (79%)	n=12 (15,6%)	n=4 (5,2%)	n=6 (7,8%)

Как видно из результатов, представленных в таблице 2, из общего количества пациентов у 61 (79%) не выявлено генетических мутаций, ассоциированных с высоким риском развития тромбоза. У 4 пациентов с наследственной тромбофилией (группа 3) присутствовали как артериальные, так и венозные тромбозы. В группе 4 мутации присутствовали у 6 пациентов, однако без развития тромботических осложнений. В группе 2, которую составили 12 пациентов (15,6% от общего числа) без наследственной тромбофилии, тромбозы возникали в основном в острый период заболевания. В период реконвалесценции лишь у одного пациента был эпизод тромбофлебита, причем у него не было выявлено ни одной из про-тромбогенных мутаций. Таким образом, наши данные подтверждают сведения из литератур- ных источников, демонстрирующие, что присутствие мутаций FV G1691A и FII G20210A у пациентов с новой коронавирусной инфекцией не всегда приводит к развитию тромбоза.

Значительная роль в обеспечении гемостати ческого баланса принадлежит системе естествен ных антикоагулянтов : антитромбина и системе протеина С . Для оценки влияния антикоагулянт ной профилактики на активность АТ , РС и уро вень PS, были выделены две группы пациентов : пациенты , получающие ПОАК и без таковой ( та блица 3).

Таблица 3

Показатели активности и / или уровня естественных антикоагулянтов у пациентов , перенёсших COVID-19, в сравнении со здоровыми лицами ( Ме , Q1-Q3)

Показатели	Контрольная группа (n = 68)	Пациенты, не получающие ПОАК (n = 34)	Пациенты, получающие ПОАК (n = 43)
АТ,%	94,0 81,5–105,5	103,0 91,0–109,0	106,0* 97,5–112,5
РС,%	102,0 89,5–114,3	114,5* 104,3–128,0	121,0* 107,0–132,0
PS,%	102,0 86,0–109,0	105,5 95,8–117,0	107,5 95,0–118,0

Примечание: * - p <0,025 по сравнению с контрольной группой

Как видно из результатов , представленных в та блице 3, между пациентами , получающими ПОАК и пациентами , которые уже завершили курс антикоа гулянтной профилактики в течение 45 дней на мо мент обследования , не отмечено значимых различий ни по одному из показателей . При этом уровень сво бодного Р S не отличался от нормальных значений , тогда как активность РС была выше одноименного показателя здоровых лиц , что , возможно , отражает компенсаторную реакцию на наличие изменений , способствующих развитию гиперкоагуляции . Ак тивность антитромбина превышала значения кон трольной группы только у больных , принимающих ПОАК . При этом , как уже отмечено , выраженной разницы с параметрами пациентов , закончивших приём антикоагулянтных препаратов , отмечено не было . Исходя из представленных в литературе дан ных , распространенность дефицита естественных антикоагулянтов у больных с венозным тромбозом невысока – менее 5%, а в общей популяции в десят ки раз ниже [18-20]. Данным обстоятельством и не большим количеством пациентов можно объяснить то , что ни у одного из обследованных пациентов с COVID-19 не было выявлено дефицита антикоагу лянтов .

Одним из маркеров приобретенной тромбофи лии является наличие аФА , в том числе волчаночно го антикоагулянта . При обследовании пациентов на наличие ВА для исключения ложноположительного результата прием антикоагулянтов был отменен минимум за сутки до лабораторного тестирования [28, 30]. По итогам наблюдений только у одного па циента из обследованной группы был выявлен ВА , при этом показатель нормализованного отношения составлял 1,21, что соответствует сомнительному результату . Согласно рекомендациям [28], при вы явлении аФА требуется подтверждение их наличия через 12 недель от первого исследования . При про ведении повторного исследования на наличие ВА у данного пациента был получен отрицательный ре зультат , что согласуется с литературными данными об отсутствии ВА у пациентов , перенесших COVID-19 [22-24].

Исходя из приведённых выше данных, можно с уверенностью сказать, что окончательная роль аФА волчаночного типа в данной ситуации при течении COVID-19 ещё не определена и значение ВА в развитии тромбозов окончательно не выяснено и требует дальнейшего исследования.

Заключение. На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что классические наследственные тромбофилии, такие, как носительство мутации FV Leiden и мутации 20210A гена протромбина, а также дефицит естественных антикоагулянтов – антитромбина, протеина Р и протеина S – не играют значительной роли в развитии тромбозов при новой коронавирусной инфекции. В то же время сочетание полиморфизмов генов различных компонентов системы гемостаза, таких, как генотипическое сочетание противовоспалительных цитокинов IL-6 -174 CC / IL-1B -31 ТС, мутации протромбоген-ных генотипов фактора FXIII (FXIII-A 163 TT) и фибриногена (FI-B -455 AA генотипа PAI-1 5G/5G) влияет на формирование тромба у пациентов с COVID-19. Кроме того, по данным литературы [6, 8, 31] к наследственным тромбофилиям могут добавляться приобретенные факторы риска развития тромбоза, такие как аФА, а также заболевания, которые не являются прямой причиной заболевания, но, при определенных условиях, повышают вероятность развития тромбоэмболических осложнений. К таким заболеваниям относится ряд гематологических заболеваний, таких, как пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гепарин-индуцированная тромбоцитопения, серповидноклеточная анемия, различные новообразования и др. [32, 33]. В научной литературе опубликованы данные о значительной роли высокого артериального давления, которое является одним из основных сопутствующих заболеваний, повышающих риск инсульта и смерти от COVID-19 [34]. Кроме этого, A.B. Docherty еt al. доказали, что ожирение в значительной степени связано с более высокой внутрибольничной смертностью от тромбоза, а также сопутствующими заболеваниями, такими как хронические болезни сердца, лёгких, почек и печени [35]. Малоподвижный образ жизни, избыточный вес, курение также могут способствовать развитию ВТЭО [34, 36], поэтому наличие тромбо- филического дефекта при новой коронавирусной инфекции следует рассматривать как один из многих факторов, который может реализоваться развитием тромбозов различной локализации.

Таким образом, несмотря на многочисленные публикации о развитии тромботических осложнений у пациентов с COVID-19, роль тромбофилии окончательно не выяснена. Новая коронавирусная инфекция продолжает распространяться и результаты могут быть пересмотрены в будущем после более масштабных и качественных исследований и тщательного ретроспективного анализа накопленного клинического опыта, в свете новых данных о патогенезе COVID-19.