Сигнальная функция активных форм кислорода при интоксикации тиопенталом натрия

агент угнетением функции центральной нервной системы (ЦНС), что в свою очередь приводит к развитию осложнений со стороны органов дыхания, кровообращения и других жизненно важных систем. Данные обстоятельства вызывают увеличение концентрации высокореакционных сигнальных молекул для адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям среды, в том числе и активных форм кислорода (АФК).

Известно, что стационарный уровень свободнорадикальных соединений в клетке достаточно низкий, так как регулируется специальной системой антиоксидантной защиты. В случае отклонения от сбалансированного метаболизма, вызванного применением лекарственного препарата, наблюдается возрастание уровня АФК. Перепроизводство АФК опасно для существования клеточного сообщества и надлежащего выполнения ими соответствующих функций, так как индуцирует апоптоз, чтобы удалить поврежденные структуры [1]. Вероятность такого развития событий при отравлениях депримирующими препаратами на сегодняшний день изучена недостаточно. Поэтому данные исследования являются актуальными для медицинской токсикологии.

Цель исследования: экспериментальное изучение изменения активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы (СОД), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД), глутатионпероксидазы (ГП)), активности ферментов апоптоза каспазы 3 и каспазы 9 и концентрации пигментного фактора эпителиального происхождения (PEDF) в плазме крови крыс в зависимости от стадии интоксикации тиопенталом натрия в дозе LD50.

Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 40 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г из питомника РАМН «Рапполово». Длительность карантина (акклиматизационного периода) для животных составляла 14 дней. Содержание и использование животных в эксперименте проводилось согласно норм GLP. В контрольной и каждой экспериментальной группах было по 10 животных. Введение тиопентала натрия производили внутрибрюшинно в дозе LD 50 за 6, 24 и 72 часа до взятия биологического материала. Для взятия материала для исследований от лабораторных животных производили декапитацию крыс и собирали кровь в гепаринизированные пробирки. Полученную кровь центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге при 3000 об/мин и температуре +4ºC. В плазме крови экспериментальных животных определяли концентрацию PEDF (тест-система фирмы «Сhemi-con international», USA&Canada), активность каспазы-3 и каспазы-9 (тест-система фирмы eBioscience, Austria) с помощью иммунофер-ментного анализа на приборе Immunotech.

После отделения плазмы эритроцитарную взвесь троекратно отмывали холодным физиологическим раствором, а затем центрифугировали в соответствии с методиками проведения данных исследований указанных в наборах фирмы «Randox». Гемолиз эритроцитов осуществляли добавлением эритроцитарной взвеси в 5 мМ ТРИС-HCl буфер с pH 7,6 в соотношении 1:9. Гемолизированная кровь выдерживалась в течение 30 мин при +4°C. Полученный гемолизат использовали для определения биохимических показателей антиоксидантной системы: активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД). Для определения активности ферментов антиоксидантного статуса были использованы наборы фирмы «Randox» (Великобритания). Контроль качества выполняемых методик проводили с использованием контрольных материалов фирмы «Randox». Результаты исследований были обработаны при помощи пакета статистического анализа данных «Statistica».

Полученные результаты и их обсуждение. В результате проведенного исследования были получены следующие результаты, представленные в табл. 1. Тиопентал натрия – производное тиобарбитуровой кислоты, в зависимости от дозы разнонаправленно изменяет активность ГАМКА-зависимого быстрого ионотропного канала на постсинаптической мембране нейронов головного мозга. В больших дозах (LD50) непосредственно активирует ГАМКА-рецепторы, оказывая ГАМК-стимулирующее действие. Препарат увеличивает интенсивность метаболических процессов в головном мозге, утилизацию мозгом глюкозы и кислорода. В больших дозах угнетает дыхательный центр и уменьшает его чувствительность к углекислому газу [2].

Таблица 1. Полученные результаты

Примечание: *– достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05)

В условиях воздействия на экспериментальных животных тиопенталом натрия активность ферментов антиоксидантной защиты в гемолизате эритроцитов крысы отражала процессы запуска масштабного окислительного стресса. Основной причиной служит образование АФК – кислорода, восстановленного до супероксида кислорода и перекиси водорода. Обе эти формы являются предшественниками гидроксил-радикала ОН- , сильнейшего окислителя, разрушающего все жизненно важные структуры живой клетки, включая ДНК [3].

СОД – антиоксидантный фермент, метал-лопротеин, представляет первое звено защиты при увеличении концентрации активных молекул кислорода в клетке. Полученные экспериментальные данные показали, что активность СОД резко снижается и продолжает оставаться на предельно низком функциональном уровне во все временные интервалы исследования. Снижение активности СОД на 60% к 3 суткам указывает на значимость быстрой истощаемости естественных антиоксидантных систем в реализации повреждающего потенциала оксидативного стресса.

Следующим звеном в процессе утилизации АФК являются ферменты системы глутатиона. Биологическое значение системы глутатиона многообразно и затрагивает почти все стороны жизнедеятельности клетки. Например, конъюгация ксенобиотиков и их метаболитов, защита от повреждающего действия АФК, поддержание тиол-дисульфидного равновесия и восстановленной среды клетки, поддержание гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии, восстановление метгемоглобина и защита эритроцитов от гемолиза, транспорт аминокислот через клеточную мембрану, поддержание оптимального состояния и функций биологических мембран и т.д. [4]. К ферментам обмена глутатиона относится глутатионпероксидаза, принимающая участие в регуляции тиолдисульфидного равновесия в клетке. ГП – селеногликопротеин, не связанный с мембранами, присутствует в цитозоле клеток и практически во всех органеллах, катализирует восстановление H 2 O 2 и водорастворимых органических гидроперекисей (алифатических и циклических углеводородов, полиненасыщенных жирных кислот, глицерина, холестерина, прогестерона, простагландинов и т.д.). В проведенном эксперименте через 6 часов активность глутатионпероксидазы незначительно снижалась на 4% по сравнению с контрольной группой. Через 24 часа активность фермента повышалась на 13% по сравнению с показателями контрольной группы. К концу третьих суток (72 часа) активность фермента возрастала на 41% к значениям контрольной группы.

В процессе утилизации перекисей глутатионпероксидаза в качестве кофактора использует восстановленный глутатион, который в результате превращается в окисленный. Для обратного превращения окисленного глутатиона в восстановленный необходимо достаточное количество восстановленного НАДФН+, источником которого являются реакции окислительной части пентозофосфатного шунта. Ключевым и скорость лимитирующим ферментом пентозо-фосфатного пути в эритроцитах является фермент глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Снижение активности Г-6-ФД может приводить к дефициту НАДФН+ и восстановленного глутатиона, а это приводит к уменьшению скорости восстановления окисленных SH-групп и как следствие, к инактивации ферментов и различных SH- содержащих белков. Активность данного фермента снижалась к концу 6-ти часового интервала на

17% по сравнению с показателями контрольных значений. К концу первых суток активность фермента оставалась на том же пониженном уровне. К концу третьих суток активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы продолжила падение и составила 68% по сравнению с уровнем контрольных значений.

В зависимости от уровня АФК и метаболических изменений возможны различные варианты развития «сценария» при отравлении тиопенталом натрия в дозе LD 50 . Активация компенсаторных механизмов приводит к инициации ангиогенеза, пролиферации и соответственно, выживанию организма. Срыв адаптивных возможностей запускает нарастающую деструкцию клеток по механизму некроза или апоптоза, соответственно, гибель организма. Образование АФК, стимулируемое в клетках при участии ксантиноксидазы, eNOS, NAD(P)H оксидазы, активирует сигнальные белки тирозинкиназы (р38МАРК, JNK), связанные в свою очередь, с транскрипционными факторами ядерного аппарата клетки (NF-κB, STAT1) [5]. NF-kB является одним из главных транскрипционных факторов, отвечающих за адаптивные реакции клеток.

В нашем исследовании, исходя из полученных данных, развитие событий пошло по пути развития апоптоза, так как активность ферментов апоптотического каскада, каспазы 3 и каспазы 9 в плазме крови крыс резко повышается по сравнению с контрольными значениями [6]. Активность каспазы-3 повышается через 6 часов на 30%, в тоже время активность каспазы 9, главного «регулятора» активности каспазы 3, повышается на 175% по сравнению с контрольными значениями. Развитие процесса приводит к нарастанию активностей этих ферментов. Интересно, что к окончанию первых суток активность каспазы 9 еще раз резко повышается, в 1,34 раза по сравнению с уровнем активности на 6 часов.

Фактором, защищающим нейрональные клетки от апоптоза, является PEDF. Известно, что PEDF – ингибитор сериновых протеаз, является одним из факторов защиты клеток от апоптоза, что предполагает участие данного гликопротеина в разных процессах жизнедеятельности клетки [7]. В работах Yamagishi et al. описаны пролиферативные изменения, вызванные эпителиальным ростовым фактором (PEDF) при окислительном стрессе в клетках эндотелия при диабетической ретинопатии [8]. В проведенном исследовании концентрация PEDF в плазме крови крыс резко снижается. Через 6 часов после отравления содержание PEDF на 92% ниже уровня контрольных значений. Такая тенденция сохраняется в течение первых суток и уровень PEDF составляет 15% от контрольных значений. По некоторым данным основой механизма анти-апоптотического действия РEDF на нейроны является активация транскрипционного фактора NF-κB [9]. Полученные результаты подтверждают роль данного фактора в регуляции процессов апоптоза.

Выводы: выявлено, что отравление тиопенталом натрия крыс в дозе LD 50 приводит к увеличению концентрации АФК в клетке и активации сигнальных тирозинкиназ. Данный процесс сигнализирует о срыве адаптивных возможностей организма, проявляющехся в снижении активности ферментов антиоксидантной защиты СОД и Г-6-ФД, повышении активности проапоптотических ферментов каспазы 9 и каспазы 3, а также снижении содержания нейротрофического фактора PEDF.