Синтез индол 3 уксусной кислоты при совместном культивировании дрожжей и бактерий

На сельскохозяйственном мировом рынке наблюдается растущий интерес к использованию биологических средств защиты растений и ростовых стимуляторов. Эта тенденция подчеркнута исследованиями [3]. Производство таких препаратов включает использование различных культур микроорганизмов, таких как ростопромо-тирующие бактерии (PGPB) и грибы (PGPF) [4, 5]. Современные исследования акцентируют внимание на способности PGPB и PGPF к синтезу природных гормонов роста, таких как ауксины, цитокинины и гиберилины [1, 7, 8]. Производство этих веществ микробиологическим путем может привести к экономическому эффекту в сельском хозяйстве. Некоторые исследования демонстрируют, что определенные штаммы Pseudomonas не только обладают фунгицидными свойствами, но и способны синтезировать ауксины [6]. Наши исследования фокусировались на совместном культивировании бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. auerofaciens B 5326 и дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y 4317, где мы выявили их способность синтезировать фитогормоны и накапливать их в культуральной жидкости. Эксперименты с совместным культивированием PGPB [13] и PGPF [14, 15] предоставляют основу для разработки комплексных биопрепаратов, которые могут воздействовать на сельскохозяйственные культуры и оцениваться по их фитогормональ-ной активности.

Материалы и методы

Цель исследования: оценка возможности синтеза IAA при совместном культивировании бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp . auerofaciens B-5326 и дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-4317.

Задачи: 1) исследование возможности совместного культивирования PGPB и PGPF 2) исследование способности синтезировать IAA P. chlororaphis и S. Сerevisiae в присутствии/ отсутствии L-триптофана 3) Оценка способности S. Сerevisiae синтезировать триптофан.

В качестве посадочного материала использовали штаммы бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens B-5326 и дрожжей Saccharo-myces cerevisiae Y-4317 (Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика).

Режимы культивирования микроорганизмов и состав питательной среды. На первом этапе культивирование исследуемых микроорганизмов осуществляли раздельно в колбах объемом 250 мл на шейкере-инкубаторе SPH-2102 (BIORUS, Минск, Беларусь) при температуре 28 °С и частоте перемешивания 130 RPM. Среда для выращивания микроорганизмов содержала глюкозу 10 г/л, NaNO3, (NН4)2SO4, NH4NO3, КН2РО4 – по 0,5 г/л.

дрожжевой экстракт 1 г/л. Спустя 48 ч титр посадочного материала составил 10⁷ и 10⁵ КОЕ/мл для P. chlororaphis и S .сerevisiae , соответственно. На втором этапе из двух колб отбирали по 15 мл культуральной жидкости и переносили в колбу объёмом 500 мл. Состав питательной среды для совместного роста микроорганизмов: свекловичная меласса 25 г/л пептон 0,5 г/л, дрожжевой экстракт 1 г/л, NaNO 3 , (NН 4 ) 2 SO 4 , NH 4 NO 3 , КН 2 РО 4 – по 0,5 г/л.

Определение содержания аминокислот: определяли методом ТСХ. Использовали стандарты 20 аминокислот фирмы Sigma (США). Пробы культуральной жидкости, отбирали по 1,5 мл, центрифугировали на центрифуге MiniSpin® (Eppendorf, Гамбург, Германия) при 6000 об/мин в течение 20 мин. ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1:1 по объему) и активировали в течение 15 мин при 120 °С. Объем наносимых проб – 0,5 мкл. Подвижная фаза состояла из изобутанола, изопропанола, воды и ледяной уксусной кислоты (5:4:3:0.2 по объему), Насыщение камеры – 1,0–1,5 ч. Время разделения 1,5–2 ч.

Количественно аминокислоты определяли на денситометре CS-920 фирмы Shimadzu (Киото, Япония) и TLC Scanner 3 (Camag, Муттенц, Швейцария) при длине волны 500 нм.

Подсчёт клеток микроорганизмов осуществляли на фиксированных окрашенных мазках метод Виноградского-Брида (Теппер, 2004).

Для обнаружения в культуральной жидкости ауксина и определения его концентрации проводили реакцию Сальковского [9]. После прохождения цветной реакции концентрацию IAA определяли фотометрически на спектрофотометре UV-1900 ( Shimadzu, Киото, Япония ) при длине волны 546 нм.

Результаты

На первом этапе работы проводили совместное культивирование P. chlororaphis и S. Сerevisiae . В ходе исследования мы обнаружили активный рост колоний бактерий и дрожжей при совместном культивировании на мелассной среде. Анализируя полученную картину исследования, мы не обнаружили конкурентного взаимодействия между микроорганизмами двух таксономических групп. Это позволило нам предположить, что в КЖ отсутствуют ростингибирующие для данных организмов метаболиты.

Максимальная концентрация при совместном культивирование P. chlororaphis и S. Сerevisiae . составила (3 ± 0,2)×108 и (8 ± 0,2)×106 КОЕ/мл (рисунок 1).

Рисунок 1. Микроскопия P. chlororaphis и S. Сerevisiae при совместном культивирование

Figure 1. Microscopy of P. chlororaphis and S. Cerevisiae during co-cultivation

культивировании P. chlororaphis и S. cerevisiae мы зафиксировали увеличение содержания IAA в культуральной жидкости более чем в два раза, по сравнению с раздельным способом культивирования. Без добавления L-триптофана содержания IAA составило 102 ±5, при добавлении аминокислоты содержание IAA увеличилось незначительно в пределах ошибки (111±7 мкг/мл).

Поэтому на следующем этапе мы экспериментальным методом изучили способность данного штамма дрожжей продуцировать L-триптофан. Методом ТСХА обнаружили, что в ходе роста исследуемого штамма дрожжей в КЖ накапливается аминокислота триптофан в концентрации 44 мкг/мл (рисунок 3).

Основным показателем эффективности биопрератов является жизнеспособность клеток микроорганизмов и их способность синтезировать в среду биологически активные вещества, в нашем случае – фитогормоны [17–18]. В нашем исследовании в качестве фитогормонального-маркера в КЖ служила индол 3-уксусная кислота. Мы сравнили способность синтезировать IAA микроорганизмами при раздельном культивировании при добавлении аминокислоты триптофана (100 мкг/мл) и в её отсутствии (контроль) [19–20]

IAA, «J

Hg/ml «

P.chlororaphis P.chlororaphis

Ury

Рисунок 2. Содержание IAA в культуральной жидкости исследуемых микроорганизмов

Figure 2. IAA content in the culture liquid of the studied microorganisms

При раздельном культивировании микроорганизмов содержание IAA в культуральной жидкости S. cerevisiae составило 57±3 мкг/мл и 36±2 мкг/мл в КЖ P. chlororaphis (рисунок 2). Очевидно, что дрожжи являются основным продуцентом IAA. При добавлении в среду для роста клеток аминокислоты L-триптофан, содержание IAA достоверно увеличилось по сравнению со средой без добавления аминокислоты только в вариантах с бактериями P. chlororaphis B-5326. Содержание IAA увеличилось по сравнению с контролем на 78%. В вариантах с дрожжами S. cerevisiae содержание IAA увеличивалось пор сравнению с контролем только на 14%. Мы предположили, что дрожжи способны самостоятельно синтезировать L-триптофан. При совместном val try tyr

Рисунок 3. Хроматограмма аминокислотного состава Saccharomyces cerevisiae Y-4317

Figure 3. Chromatogram of the amino acid composition of Saccharomyces cerevisiae Y 4317

Полученные данные подтверждают, что при совместном росте P. chlororaphis B-5326 и Saccharomyces cerevisiae Y-4317 , последние выделяют в среду достаточно аминокислоты для биосинтеза IAA микроорганизмами. Следовательно, совместное культивирование дрожжей и бактерий позволяет не только повысить жизнеспособность бактерий в логарифмическаю фазу роста, но и накапливать в среде больше IAA за счёт синтеза дрожжами триптофана.

Обсуждение

Известно, что L-триптофан является предшественников индол-3 – уксусной кислоты в метаболизме растений, некоторых бактерий и грибов. Бактерии рода Pseudomonas способны синтезировать IAA по индол-3-ацетамидному пути, где основным компонентом является L-триптофан. Ключевым ферментом при синтезе является индолацетамид гидролаза [2] основным предшественником – L-триптофан. В ранее проведенных исследованиях [3] показано, что бактерии Pseudomonas putida, Pseudomonas sp способны синтезировать IAA в концентрации 16 μg/mL без присутствия экзогенного L-триптофана и 108 μg/mL при его добавлении в среду в концентрации 0,2 g/L [16] Результаты нашего эксперимента согласуются с вышеописанными.

Pronin A.S. et al. Proceedings of VSUET, 2023, vol. 85, no. 4, pp. 91-95

Но в своей работе мы использовали более низкую концентрацию триптофана.

Другие авторы так же отмечают способность некоторых дрожжей таких как Sporobolomyces, Taphrina, Metschnikowia, Aureobasidium синтезировать ауксины [11]. В исследованиях [10], показано, что S. cerevisiae с делециями в двух генах (Ald) не способен конвертировать радиоактивно меченый Trp в IAA, но продуцирует IAA в отсутствие L-Trp и на уровнях выше, чем у дикого типа штамма дрожжей. Эти данные предполагают, что дрожжи могут иметь несколько путей синтеза IAA. Таким образом, при совместном росте с S. cerevisiae и P. chlororaphis увеличение синтеза IAA у последних, можно объяснить способностью накапливать триптофан в культуральной жидкости S. cerevisiae .

Заключение

Настоящая работа посвящена изучению возможности совместного культивирования PGPB и PGPF микроорганизмов. Мы показали,

(8 ± 0,2)×106 КОЕ/мл.

В ходе исследования обнаружили, что микроорганизмы P. chlororaphis и S. cerevisiae при совместном культивировании способны синтезировать IAA в максимальной концентрации 111±7 мкг/мл. В исследованиях с добавлением триптофана обнаружили, что экзогенное введение аминокислоты стимулирует накопление IAA в КЖ только у P. chlororaphis . Таким образом, мы предполагаем, что основным источником триптофана при совместном культивировании микроорганизмов является S. cerevisiae . Полученные данные являются предпосылкой к созданию комплексного биологического препарата для обработки растений и подтверждает нашу гипотезу о возможности совместного культи-вирвоания PGPB и PGPF.