Сэндвич-метод твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса блютанга

Не вдаваясь в описание известных данных по этому заболеванию, надо сказать, что в прошлом столетии блютанг нанес овцеводству в мире б о льший экономический ущерб, чем все другие инфекционные заболевания овец взятые вместе (1). Эпизоотии блютанга наносят наибольший вред на ранее благополучных территориях, где заболеваемость составляет до 90 %, а летальность — 70-90 % (2). Однажды возникнув в регионе болезнь приобретает стационарный характер и в настоящее время зарегистрирована на всех континентах.

Ранее лабораторную диагностику и серологический мониторинг блютанга проводили, используя реакции связывания комплемента (РСК), преципитации (РДП), нейтрализации (РН), иммуноферментный анализ (ИФА) (3-5). В этих реакциях антигены вирусов группы блютанга, как и специфические антитела, перекрестно реагируют со специфическими антителами и соответствующими антигенами близкородственных возбудителей групп эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГ-БО), болезней Ибараки, Эбенанджи и Пальям (6-8). Однако эти методы не позволяют детально проанализировать структурно-функциональную организацию возбудителя, что является причиной не всегда достоверных результатов исследований как при групповой диагностике, так и при типизации вновь выделенных изолятов.

Южные и юго-восточные регионы Российской Федерации граничат со странами, стационарно неблагополучными по блютангу, однако особую актуальность проблема приобрела после вспышки эпизоотии этой болезни впервые в Бурятии в 1993 году. Вероятность заноса возбудителя блютанга в Россию существует постоянно. После вспышки эпизоотии блютанга в 1999 году в Болгарии, с которой Россия имеет довольно тесные экономические и культурные связи, эта вероятность возросла, поэтому остаются актуальными исследования причин и динамики возникновения и протекания этого заболевания, создание средств специфической профилактики и целенаправленное конструирование диагностических иммунореагентов с заранее определенной функциональной и антигенной специфичностью.

Целью наших исследований была разработка средств лабораторной дифференциальной диагностики блютанга при моно- и орбивирусных смешанных инфекциях на основе эпитопного анализа вирусных полипептидов с использованием моноклональных антител.

Описание методики . В работе использовали различные препараты моноклональных антител (МА), обладающих специфичностью к антигенным детерминантам 114

полипептида VP7 внутреннего капсида вируса блютанга и неструктурного полипептида NS1 этого возбудителя: в очищенном виде; конъюгированные с пероксидазой хрена; специфические к вирусу блютанга поликлональные иммуноглобулины из им-муноасцитической жидкости мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена; 10 % суспензию мозга 2-10-суточных мышей, зараженных вирусом блютанга (штамм Иль-ичевский и серотип 16); культуральные препараты специфических вирусных антигенов в виде лизатов клеток различных культур (почки сибирского горного козерога — ПСГК, почки хомяка — ВНК-21, почки сайги — ПС, почки зеленой мартышки — CV-1), инфицированных вирусами блютанга (серотипы 1, 2, 3, 4, 9, 12, 14, 16 и 17), болезни Ибараки, ЭГБО, африканской чумы лошадей и гетерологичными возбудителями. В качестве гетерологичных антигенов применяли культуральные антигены следующих вирусов: ЭГБО (серотипы 1 и 2), африканской чумы лошадей, болезней Ибараки, Акабане и Найроби, лихорадки долины Рифт, оспы овец и коз, чумы мелких жвачных и крупного рогатого скота, а также 10 % суспензию мозга 2-10-суточных мышей, зараженных вирусами ЭГБО (серотипы 1 и 2) и болезни Ибараки. Для приготовления антигенных препаратов культуры клеток выращивали в матрасах Ру до образования полного монослоя (2 сут) и заражали одним из возбудителей на 512-м пассаже при множественности заражения 100-1000 ТЦД 50/см ³; максимальное накопление антигенов наблюдали на 60-72-й ч культивирования (на монослое фиксировали признаки цитопатогенного действия вирусов). Надосадочную жидкость удаляли, монослой клеток промывали физиологическим раствором и замораживали при – 70 ^оС. После оттаивания разрушенные клетки и вирусный антиген смывали со стекла небольшим количеством физиологического раствора; клеточный детрит удаляли центрифугированием при 600 g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве антигенов, активность которых оценивали в РДП и РСК с использованием гипериммунных сывороток овец и крупного рогатого скота и непрямого метода твердофазного ИФА (ТФ ИФА) с гипериммунными сыворотками мышей линии BALB/с (доноры иммунных лимфоцитов при получении специфических МА к антигенам вируса блютанга). Титр антигенов в РДП, РСК и ТФ ИФА составлял соответственно 1:16; 1:32 и 1:6250. Антигены из неинфицированной культуры клеток (контроль) готовили аналогичным способом.

П о с т а н о в к а с э н д в и ч - м е т о д а Т Ф И Ф А. Для сенсибилизации твердой фазы в лунках пластин в течение 18 ч при температуре 4 оС икубировали по 0,1 см3 0,02 М карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ) (pH 9,6), содержащего МА в различных концентрациях (номера клонов приведены в таблице 1). В лунки вертикальных рядов вносили специфические, гетерологичные и нормальные культуральные антигены в последовательных разведениях на фосфатно-солевом буфере (ФБР) с добавлением 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05 % Твин-20 (ФБР-Т-БСА). Пластины инкубировали при 37 оС в течение 1 ч. В лунки вносили по 0,1 см3 ФБР-Т-БСА, содержащего препараты моно- и поликлональных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в рабочих разведениях. Пластины инкубировали при 37 оС в течение 1 ч. Между каждым этапом инкубации пластины 3 раза промывали в ФБР-Т, а перед внесением хромогенного субстрата — 5 раз в ФБР-Т и 1 раз в ФБР. В лунки вносили раствор хромогенного субстрата и через 30 мин анализировали.

П ригодность МА для применения в методах дифференциальной диагностики блютанга определяли по максимальной активности в непрямом методе ТФ ИФА и изотипу антител. Предпочтение было отдано МА с изотипом IgG2, специфичным к линейным (не конформационнозависимым) антигенным детерминантам.

Отбор препаратов МА, пригодных для использования в лабораторной диагностике блютанга, проводили одновременно с разработкой сэндвич-метода ТФ ИФА для обнаружения антигенов вируса блютанга в инфицированных культурах клеток, мозге 2-10-суточных мышей, пробах крови и органов инфицированных животных. Оценивали эффективность метода для обнаружения группоспецифических антигенов вирусов группы блютанга серотипов 1-20 и их дифференцирования от антигенно- родственных возбудителей болезни Ибараки, ЭГБО, африканской чумы лошадей и гетерологичных возбудителей.

В ходе разработки сэндвич-метода ТФ ИФА определяли оптимальную температуру, продолжительность и режим процедур, сенсибилизирующие дозы МА и эффективность последних. При этом очищенные МА использовали для сенсибилизации твердой фазы пластин, а МА, конъюгированные с пероксидазой хрена, — для выявления специфических антигенов, связанных на твердой фазе пластин очищенными МА. При выборе сочетаний препаратов МА, используемых для сенсибилизации твердой фазы пластин и в виде конъюгатов для выявления антигена, руководствовались специфичностью МА к неперекрывающимся антигенным детерминантам полипептида VP7 внутреннего капсида вируса блютанга или неструктурного полипептида NS1 этого возбудителя.

При определении сенсибилизирующей дозы МА для сэндвич-мето-да ТФ ИФА в лунки двух вертикальных рядов пластин вносили по 0,1 см3 0,02 М КББ (рН 9,6), содержащего МА в концентрациях 25-0,04 мкг/см3. Пластины инкубировали в течение 18 ч при 4 оС. Свободные сайты связывания полистирола блокировали БСА, инкубируя в лунках панелей по 150 см3 ФБР-Т-БСА в течение 30 мин при 37 оС. В лунки вносили по 0,1 см3 ФБР-Т-БСА, содержащего в четных вертикальных рядах нормальный антиген, в нечетных — специфический антиген в рабочем разведении. Пластины инкубировали при 37 оС в течение 1 ч. Затем в лунки вносили по 0,1 см3 ФБР-Т-БСА, содержащего пероксидазные конъюгаты МА, а также пероксидазный конъюгат специфических к вирусу блютанга поликлональных иммуноглобулинов из иммуноасцитической жидкости мышей в рабочих разведениях, рассчитанных для прямого метода ТФ ИФА. Пластины инкубировали в течение 60 мин при 37 оС. Между каждым этапом инкубации пластины 3 раза промывали в ФБР-Т, а перед внесением хромогенного субстрата — 5 раз в ФБР-Т и 1 раз — в ФБР. В лунки вносили хромогенный субстрат и через 30 мин анализировали. Сенсибилизирующей дозой считали концентрацию МА, при которой разница между оптической плотностью субстратного раствора специфических и нормальных антигенов была максимальной (см. табл. 1).

• 1.    Оценка оптимальной сенсибилизирующей дозы моноклональных антител (МА) , обладающих специфичностью к антигенным детерминантам неструктурного полипептида NS1 и полипептида VP7 внутреннего капсида вируса блютанга, для сэндвич-метода ТФ ИФА ( n = 3)

  ¹ клона МА, сенсибилизирован-ного на твердой фазе пластин	Сенсибилизирующая доза МА, конъюгированных с пероксидазой хрена, мкг/см3
  Клоны МА, специфичные к антигенным детерминантам неструктурного полипептида NS1 вируса блютанга
  	Бт1.2.1	Бт25.1	Бт53.3.1	Бт65.2	Поликлональные антитела
  Бт3.4                                            1,6           –            1,6           1,6              0,8 Бт17.2.2                                         0,4          0,4           0,4           0,8              0,8 Бт22.3                                           0,8          1,6           0,8           0,8              1,6 Бт41.3.1                                         0,8          1,6           0,8           0,8              0,8 Бт35.2                                               1,6           1,6             1,6             1,6               1,6 Бт62.1.2                                         0,8           –             –             –               1,6 Бт27.2                                               0,8           1,6             1,6             –                1,6 Бт45.2                                           0,2          0,2           0,4           0,2              0,8 Бт73.3                                               0,8           1,6             1,6            0,8               1,6 Клоны МА, специфичные к антигенным детерминантам полипептида VP7 внутреннего капсида вируса блютанга
  	Бт34.2.2	Бт6.2	Бт52.2	Бт67.3.2	Поликлональные антитела
  Бт23.1.2                                         0,8          0,4           0,8           0,8              0,8 Бт31.4.2                                         0,4          0,4           0,4           0,8              3,2 Бт37.2.2                                         0,4          1,6           0,8           0,8              1,6 Бт11.2.2                                         0,4          1,6           0,8           0,8              0,8 Бт14.3.2                                       –          0,4           –            –             0,4 Бт19.3.1                                         0,4          0,4           0,4           0,4              0,4 Бт7.1.2                                              0,8           1,6             1,6             1,6               1,6 Бт47.3.2                                         0,2          0,2           0,4           0,2              0,8 Бт72.2                                           1,6          1,6           1,6           0,8              3,2 Бт74.2                                           0,8          1,6           1,6           1,6              3,2 П р и м е ч а н и е. Прочерк означает отсутствие реакции.

• 2.    Оценка чувствительности и специфичности сэндвич-метода ТФ ИФА при обнаружении полипептида VP7 внутреннего капсида и неструктурного полипептида NS1 вируса блютанга ( n = 3)

  Антигены вируса	Полипептид VP7 внутреннего капсида вируса блютанга			Неструктурный полипептид NS1 вируса блютанга
  блютанга	Клон МА, сенсибилизированный на твердой фазе пластин (конъюгат)
  	Бт37.2.2. (МА клона	Бт11.2.2 (МА клона Бт6.2)	Бт37.2.2. (поликлонального	Бт17.2.2 (МА клона	Бт3.4 (МА клона	Бт17.2.2. (поликлонального
  	Бт6.2)		специфического Ig)	Бт1.2.1)	Бт65.2)	специфического Ig)
  		С п е ц и ф и ч е с к и е к у л	ь т у р а л ь н ы е а н т и г е н ы	в и р у с а б л ю т а н г а
  Серотип:
  1	1:2430	1:7290	1:7290	1:2430	1:810	1:21870
  2	1:2430	1:7290	1:7290	1:2430	1:810	1:7290
  3	1:7290	1:21870	1:21870	1:7290	1:2430	1:65610
  4	1:2430	1:7290	1:7290	1:2430	1:810	1:21870
  6	1:810	1:2430	1:2430	1:810	1:90	1:7290
  9	1:2430	1:7290	1:7290	1:2430	1:810	1:21870
  14	1:2430	1:7290	1:7290	1:7290	1:7290	1:65610
  16	1:2430	1:2430	1:2430	1:2430	1:2430	1:7290
  17	1:810	1:2430	1:2430	1:2430	1:810	1:7290
  Штамм::
  Нахичевань	1:810	1:2430	1:2430	1:7290	1:2430	1: 21870
  Ильичевский	1:810	1:7290	1:7290	1:7290	1:7290	1: 21870
  Веа	1:810	1:2430	1:2430	1:7290	1:2430	1:7290
  	10 % с у с п е н з и я м о з г а 2-10-с у т о ч н ы х м ы ш е й, и н ф и ц и р			о в а н н ы х в и р у с о	м б л ю т а н г а
  Штамм Ильичевский	1:32	1:64	1:64	1:128	1:64	1:512
  Серотип 16	1:64	1:128	1:128	1:256	1:128	1:1024
  П р и м е ч а н и е. В препаратах из неинфицированных культур клеток (контроль), а также инфицированных вирусами эпизоотической геморрагической болезни оленей (серотипы 1						и 2), болезни Ибараки, африкан-
  ской чумы лошадей, чумы мелких жвачных, оспы овец и коз реакция отсутствовала.

  пептида NS1 вируса блютанга, позволило повысить чувствительность сэндвич-метода ТФ ИФА в 2-4 раза без снижения его специфичности. В результате замены препарата МА, конъюгированных с пероксидазой хрена, для выявления связавшегося антигена, на пероксидазный конъюгат специфических поликлональных антител из иммуноасцитической жидкости крыс чувствительность метода повысилась еще в 2-4 раза и составляла 1000 ТЦД_50/см³, причем в этом варианте сохранялась способность дифференцировать антигены вируса блютанга от антигенов других вирусов (см. табл. 2).

Эти концентрации использовали при определении чувствительности и специфичности сэндвич-метода ТФ ИФА и его пригодности для обнаружения группоспецифических антигенов вируса блютанга в культуральных вируссодержащих материалах и пробах патологического материала.

О ц е н к а э ф ф е к т и в н о с т и с э н д в и ч - м е т о д а Т Ф И Ф А п р и г р у п п о с п е ц и ф и ч е с к о й д и а г н о с - т и к е в и р у с а б л ю т а н г а. Для выявления антигенов структурного полипептида VP7 внутреннего капсида и неструктурного полипептида NS1 вируса блютанга определяли титр специфических антигенов этого вируса и возможные перекрестные реакции с антигеннородственными вирусами ЭГБО, болезни Ибараки, африканской чумы лошадей и гетерологичных возбудителей (табл. 2).

При использовании иммунопрепаратов, изготовленных на основе МА, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам полипептида VP7 внутреннего капсида вируса блютанга, как для сенсибилизации твердой фазы пластин, так и для выявления связавшегося антигена, были обнаружены группоспецифические антигены всех исследованных серотипов. При этом метод позволяет дифференцировать анализируемый антиген от антигенов близкородственных вирусов ЭГБО (серотипы 1 и 2), болезни Ибараки, африканской чумы лошадей, а также вирусов других семейств (см. табл. 2). Замена моноклональных иммунореагентов, используемых для выявления связавшегося антигена, на поликлональные иммунореагенты не дала ожидаемого повышения чувствительности метода.

Применение препаратов, изготовленных на основе МА, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам неструктурного поли-

Сэндвич-метод ТФ ИФА был апробирован на практике при проведении экс-пертизных исследований на наличие вируса блютанга. Так, при вспышке болезни в Забайкалье во ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии были направлены для анализа законсервированные в жидкости Эдингтона пробы крови и органов павших и убитых в агональном состоянии животных с подозрением на блютанг. При анализе этих проб традиционными методами лабораторной диагностики вирус блю-танга не удалось обнаружить. Вероятно, чувствительность этих методов была недостаточной для выявления антигенов этого вируса. При использовании сэндвич-метода ТФ ИФА на основе МА титры антигена вируса блютанга непосредственно в пробах крови, печени и селезенки составляли соответственно 1:8-1:16; 1:2-1:4 и 1:2.

Для идентификации возбудителей, вызывающих у овец сходные клинические признаки (болезнь Ибараки, ЭГБО, лихорадка долины Рифт, болезни Найроби и Акабане) мы использовали соответствующие диагностические наборы, однако результаты оказались отрицательными.

При внесении в культуру клеток ПСГК проб крови больных животных цито-патические изменения (ЦПД), типичные для вируса блютанга, были выявлены только на шестом пассаже, причем титр полученного вируссодержащего материала составлял 4,5 lg ЦПД_50/мл, а после проведения двух последующих пассажей — 7,0 lg ЦПД 50/мл . Параллельно с исследованием зараженных культур на наличие ЦПД вируса проводили исследования по выявлению специфического антигена вируса блютанга в инокулированных культурах прямым методом флюоресцирующих антител. Характерное специфическое свечение цитоплазмы клеток наблюдали, начиная с четвертого пассажа, то есть за два пассажа до появления ЦПД.

У мышей с клиническими признаками заболевания (потеря рефлекса сосания, паралич, анорексия и гибель) наличие вируса блютанга было отмечено уже в первом пассаже; на шестом-седьмом пассажах титр вируса составлял 8,7 lg МЛД_50/г. По данным электронно-микроскопических исследований, в культуральных концентрированных вируссодержащих препаратах содержались вирусные частицы размером 55-70 нм; вирионы были морфологически тождественны представителям рода Orbivirus семейства Reoviridae , имели типичную икосаэдрическую форму симметрии и располагались одиночно или в виде скоплений.

Концентрированные культуральные антигены из клеток ПСГК, инокулированных суспензиями патологических материалов, и сахарозо-ацетоновые антигены из мозга инфицированных 2-3-суточных мышей исследовали различными методами. При этом титр культурального антигена вируса блютанга в РДП, РСК и ТФ ИФА составлял соответственно 1:2-1:4; 1:16-1:32 и 1:64-1:256, а сахарозо-ацетонового антигена — 0; 1:16-1:32 и 1:64-1:128. Полученные данные однозначно подтвердили принадлежность выделенного возбудителя к группе вирусов блютанга. Кроме того, в изоляте не было обнаружено антигенно родственных вирусов ЭГБО и болезни Ибараки.

Таким образом, на основе полученных нами иммунореагентов разработан метод твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющий выявлять группоспецифические антигены вируса блютанга в различных вируссодержащих препаратах, а также (что особенно важно при проведении экспертизных исследований) в крови и органах зараженных животных. Этот метод одновременно позволяет дифференцировать вирус блютанга от близкородственных в антигенном отношении вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей и болезни Ибараки.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   O s b u m B. The current world status of bluetongue. Bovine-Practitione, 1990, 25: 12-14.

• 2.    S e l l e r s R.F. Bluetongue and related diseases. In: Virus diseases of food animals /Ed. E.P.J. Gibbs. N.Y.,

  1981, II: 567-584.

• 3.    J o c h i m M.M., S u z z a n e C.J. Identification of ВТ and EHD viruses by immunofluorescence with monoclonal antibodies. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnost; 26th Ann. Proc., 1983: 277-286.

• 4.    P e a r s o n J.E., J o c h i m M.M. Protocol for the immunodiffusion tests for bluetongue. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnost; 22th Ann. Proc., 1979: 531-544.

• 5.    S t o t t J.L., O s b u m B.J. Simple procedure for preparation of bluetongue virus and epizootic haemorrhagic disease virus antigens for agar gel immunodiffusion. J. Clinical. Microbiol., 1983, 18, 6: 1310-1313.

• 6.   C a m p b e l l C.H., B a r b e r T.L., J o c h i m M.M. Antigenic relationship of Ibaraki, bluetongue and

  epizootic haemorrhagic disease viruses. Vet. Microbiol., 1978, 3: 15-22.

• 7.   Y a m a k a w a M., F u r u u c h i S. Expression and antigenic characterization of the major core protein

  VP7 of Chuzan virus, a member of the Palyam serogroup orbiviruses. Vet Microbiol., 2001, 83(4): 333-341.

• 8.    H a w k e s R.A., K i r k l a n d P.D., S a n d e r s D.A. e.a. Laboratory and field studies of an antigen capture ELISA for bluetongue virus. J. Virol. Methods, 2000, 85(1-2): 137-149.

Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии                 Поступила в редакцию 4

и микробиологии, 601121, Владимирская обл., г. Покров                     декабря 2002 года

SANDWICH-METHOD OF SOLID-PHASE IMMUNOENZYMATIC

ANALYSIS ON THE BASIS OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR DETECTION OF ANTIGENES OF BLUETONGUE VIRUS

A.A. Strizhakov, M.B. Novikova, V.V. Kurinnov, A.V. Lunitsin

S u m m a r y

On the basis of epitope analysis of viral polypeptides with the use of monoclonal antibodies the authors developed the method of solid-phase immunoenzymatic analysis (SP IEA) for detection and differentiation of the group specific agents of bluetongue virus in different virus containing solutions, blood samples and sick animals organs. The data presented on efficiency, sensitiveness and specificity of sandwich-method of SP IEA for detection of non-structural polypeptide NS1 and polypeptide VP7 of virus internal capsid. It was shown that developed method permit to reveal and distinguish bluetongue virus from closely-related viruses.

Новые книги

Э р н с т Л.К., Л а п т е в Г.Ю. Использование рекомбинантных и нерекомбинантных микроорганизмов для оптимизации микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных. М., 2002, 67 с.

В книге рассматриваются симбиотические процессы в желудочно-кишечном тракте сельскохозяйственных животных. Уделено внимание адаптации штаммов микроорганизмов в кишечнике животных. Отражены условия выживаемости и стабильности рекомбинантных штаммов. Описаны возможности применения штаммов микроорганизмов — продуцентов лизина и треонина при кормлении поросят, а также целлобактерина в скотоводстве, птицеводстве, свиноводстве и рыбоводстве. Обсуждается необходимость создания коллекции целлюлозолитических ассоциаций бактерий из рубца домашних и промысловых животных для получения препаратов-пробиотиков.