Скрининг гаплотипа фертильности АН1 айрширской породы крупного рогатого скота центрального и северо-западного регионов России

АН1 айрширского скота. Изучение распространенности гаплотипа фертильности АН1 в российской популяции айрширского скота Центрального и Северо-Западного регионов России, составлявшее цель работы, было осуществлено посредством решения ряда задач (теоретическое моделирование и практическая отработка аллелеспецифической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР), экспериментальное тестирование животных айрширской породы и последующий мониторинг состояния распространения гаплотипа АН1 в популяции айрширского скота четырех областей России). Исследование 259 коров и 28 быков-производителей, разводимых в четырех областях Центрального и Северо-Западного регионов России, выявило наличие 47 скрытых носителей АH1, в том числе 37 коров и 10 быков, что соответствует частотам встречаемости, 14,3 и 35,7%, соответственно, и в среднем по породе – 16,4%. Быки-производители пяти племпредприя-тий, носители АН1 гаплотипа, принадлежат в основном линии О.Р. Лихтинг (Лайтнинг) 120135, код 19. Результаты исследования полиморфизма гена UBE3B и частоты встречаемости носителей АН1 гаплотипа в племенных стадах айрширского молочного скота России найдут свое применение в селекционно-племенной работе с породой.

Айрширская порода, LOF-мутации, ген UBE3B, гаплотип фертильности АН1.

Айрширская порода является высокоспециализированной породой молочного скота, разводится в ряде стран мира и занимает свое отдельное место среди молочных пород Старого и Нового Света. Порода отличается высокой молочной продуктивностью и качеством молока, резистентностью к различным инфекционным заболеваниям, продуктивным долголетием, прекрасными адаптационными качествами, показателями фитнеса и воспроизводства, лучшей конверсией корма и обладает пластичностью генофонда [1, с. 1; 2, с. 22]. Суммарное поголовье животных айрширской породы в России образует вторую после Финляндии по размерам мировую популяцию айршир-ского скота и насчитывает 77,67 тыс. голов, в том числе 50,82 тыс. гол. коров, что составляет 3,05% от всех коров молочных и молочно-мясных пород страны [3, с. 15]. В базе данных ВНИИПлем по национальному генофонду сельскохозяйственных животных – племенного крупного рогатого скота молочного направления продуктивности в 2018 году содержится информация о 9099 коровах [4], разводимых в 12 регионах страны, и 1017 быках [5].

Пожизненная молочная продуктивность животных айрширской породы, разводимых в племенных заводах России, сформированная с учетом экономической оценки по сумме количества молочного жира и белка за весь период использования животного, позволяет породе войти в пятерку лидирующих молочных пород России [6, с. 17; 7, с. 101–102].

В современной селекции айрширского скота России наряду с применением метода чистопородного разведения, позволившего получить заводской тип «Новоладожский», животные которого отличаются более высокой продуктивностью, живой массой, приспособленностью к промышленной технологии и устойчивостью к лейкозу [8, с. 5], используют кроссбред-ных быков пород красного корня: красной шведской, красной норвежской [9, с. 188], айрширской американского происхождения, часто получаемых с прилитием крови красно-пестрой голштинской породы [10, с. 2; 11, с. 1]. На долю неродственных пород, таких как бурая швицкая, голштинская и фризская, приходится менее 1% [12, с. 17]. Ранее было показано, что в айрширских стадах Швеции наряду с традиционными финскими линиями существуют родственные группы быков норвежского происхождения и используются производители разного направления продуктивности, что приводит к существенным фенотипическим отличиям животных, при этом некоторые производители несут кровь быков швицкой породы [13, с. 11–21].

При сохраняющемся чистопородном разведении и ведении племенных книг по породам в селекционных программах Европы все чаще используется кроссбридинг, при котором финская айрширская, красная датская и красная шведская начиная с 2010 года объединяются как совокупная композитная порода, имеющая во многом схожую селекционную историю, и разводятся в единой селекционно-племенной программе, называемой красная нордическая (Viking Red), геномно оцениваются вместе, получая единую генетическую оценку [14, с. 4486; 15, с. 13–14]. Красная норвежская порода генетически и селекционно связана с красной шведской и айрширской финской селекции [16, с. 472], в то время как красную датскую, в которой присутствуют гены не менее 8 пород, в том числе монбельярдской – 2,7%, голштинской – до 19,8% [12, с. 18], финскую айрширскую и красную норвежскую используют в селекционных программах разведения красной шведской породы [17, c. 3]. Вследствие этого быки, получаемые в Северной Европе посредством обмена генетического материала между популяциями красных скандинавских пород, приобретают генетическое родство между собой, и совместная обработка генетических данных в единой базе способствует повышению точности их геномных оценок [14, с. 4485], что ранее было показано для других пород крупного рогатого скота [18, c. 8, 19, с. 75]. Кроме того, ряд стран, такие как США, Голландия, Италия, Германия, Португалия и Австралия, работает в системе ПроКросс, используя трехпородное ротационное скрещивание голштинской, красной нордической и монтбельярдской пород [20, с. 1; 21, с. 1–3]. Эксперименты по изучению фертильности, устойчивости к маститам и молочной продуктивности кроссбредных животных красных скандинавских пород с голштинской в сравнении с чистопородными голштинскими коровами в течение пяти лактаций показали существенное улучшение показателей фертильности, здоровья и совокупной молочной продуктивности в группе кроссбредных животных [22, с. 918].

Вместе с тем в породе наблюдается тенденция снижения фертильности коров и выхода телят, вызванная генетическими причинами [23, c. 1; 24 с. 895; 25, с. 1; 26, с. 1], что является актуальной проблемой не только айрширского скота. Ранее показано, что снижение репродуктивных показателей, обусловленное генетическими факторами, названными гаплотипами фертильности, играет все более значимую роль в современном молочном скотоводстве в селекции основных молочных пород скота: голштинской и родственной ей черно-пестрой [27, с. 1; 28, с. 30; 29, с. 430–431; 30, с. 82–83], бурой швицкой [23, с. 1; 31, с. 6153; 32, с. 400], джерсей-ской [33, с. 4; 34, с. 1], симментальской [35, с. 1], монтбельярдской [36, с. 5], красной норвежской [37, с. 7–8; 38, с. 19–23]. Так, в геноме человека из аннотированных генов 7168 (33,3%) имеют важное значение и функциональность по меньшей мере одной копии каждого из этих генов жизненно необходима [39, с. D940]. Большинство LOF-мутаций приводит к ранним эмбриональным потерям из-за невозможности имплантации и дальнейшего развития эмбриона, но есть и такие, которые проявляются во второй и третий триместр беременности или постнатально как генетические дефекты [40, c. 1–2]. Экономические потери от LOF-мутаций в США оценены в 10,74 млн дол. и вызваны известными рецессивными летальными мутациями в основных четырех молочных породах скота: голштинской, джерсейской, бурой швицкой и айрширской, причем на долю первой из них приходится примерно 70% всех убытков [41, с. 7274]. Следовательно, понимание геномной архитектуры популяций крупного рогатого скота становится все более важным теперь, чем когда-либо, ввиду сложных комбинативных сочетаний генотипа животных для прогнозирования генетического прогресса, сдерживания отрицательного воздействия вредных мутаций, ответственных за генетические дефекты и инбредную депрессию [42, с. 49–58]. Возможности полногеномных исследований (WGS) в выявлении не только единичных замен (SNP) или небольших инсерций и делеций типа индел, но и фрагментов ДНК длиной более 50 п.о., представленных делециями, инсерциями, дупликациями, инверсиями и транслокациями, помогают исследованию наименее изученных структурных вариантов полиморфизмов крупного рогатого скота, которые, как считают, в значительной степени способствуют фенотипической вариабельности и имеют широкий диапазон воздействий от полезного до летального у разных видов сельскохозяйственных животных [43, с. 1–2]. Фенотипическим проявлением структурных вариантов можно объяснить дополнительную генетическую дисперсию, возникшую с изменением числа копий генов и ассоциированную с выходом молока, количества жира и белка [44, с. 1–8], и в то же время проявлением летального эффекта больших делеций у молочного скота разных пород [37, с. 6–8; 45, с. 1; 46, с. 1–2; 47, с. 10–11]. Применение в системе воспроизводства ограниченного числа высокоценных быков сопряжено с риском быстрого распространения рецессивных генетических дефектов в стадах породы [28, с. 30–31].

Именно летальным эффектом проявляется гомозиготная мутация в гене UBE3B крупного рогатого скота, расположенная на 17 BTA в диапазоне 65,9–66,2 М п.о. (сборка генома UMD 3.1 assembly) и приводящая к возникновению гаплотипа АН1 айрширского скота [48, с. 3881]. PIRM синдром айрширского скота, проявляющийся в нарушении развития и ранней смерти молодняка в айрширских стадах, представляет следствие гомозиготного состояния гена UBE3B по мутантному аллелю, является аутосомальным, рецессивным дефектом, возникновение которого обусловлено заменой последнего нуклеотида G > A в экзоне 23 гена UBE3B (rs475678587), приводящего к синонимичной замене E692E [24, с. 3, 49]. Показано, что изменение последовательности гена UBE3B приводит к нарушению сплайсинга и синтезу измененного белка убиквитин протеин лигаза E3B, обусловливающим способность специфически связываться с предназначенными для деградации белковыми субстратами и запускать сам процесс деградации, что приводит к нарушению клеточного гомеостаза [24, c. 2]. Анализ транскрипции UBE3B выявил пропуски экзонов у пораженных животных, что влекло за собой изменение белка, потерю в нем 40 аминокислот, из которых 20 находятся в сохраненном HECT-домене, каталитическом сайте белка UBE3B [50, с. 1]. Изучение родословных выявленных скрытых носителей АH1 показало, что вероятный самый старый носитель мутации – выдающийся бык-производитель USA117936 Selwood Betty’s Commander (1953 г. р.), являющийся наиболее часто используемым быком в породе, при этом ожидаемый уровень инбридинга по нему составил 11,1% [51, с. 2771, 2776]. T.A. Cooper с соавт. [48, с. 3878] было показано, что процент оплодотворения (SCR) в 618 спариваниях быков носителей АН1 с коровами, чьи отцы были носителями, снижается на 4,3±2,5%. Одним из эффектов летального действия гаплотипа АН1 является рост числа мерт- ворожденных телят на 1,4 и 2,1%, соответственно, от спариваний быков-носителей с коровами и телками, чьи отцы были носителями АН1. Вместе с тем значительного отрицательного эффекта от АН1 гаплотипа относительно ранней эмбриональной смертности плода (NRR) не наблюдалось [52, с. 102, 109]. Частота встречаемости носителей АН1 остается стабильно высокой с середины 70-х годов ХХ века, составляет примерно 26,1% в течение большого числа поколений и является самым распространенным рецессивным гаплотипом в мире [48, с. 3881; 50, с. 1].

Цель работы состояла в изучении распространенности гаплотипа фертильности АН1 в российской популяции айрширско-го скота Центрального и Северо-Западного регионов России с использованием созданной тест-системы. Задачами исследований было предусмотрено теоретическое моделирование и практическая апробация тест-системы на основе АС-ПЦР, экспериментальное тестирование животных айрширской породы и последующий мониторинг состояния распространения гаплотипа АН1 в популяции айрширского скота четырех областей России.

Новизна исследования заключается в том, что впервые была предпринята попытка оценки масштаба распространения гаплотипа АН1 четырех региональных популяций айрширского скота страны с использованием оригинальной АС-ПЦР.

Практическая значимость полученных результатов состоит в интеграции знаний о скрытых носителях АН1 в региональные программы разведения быков-производителей и коров айрширской породы.

Материалы и методы

Материалом для исследований служили пробы ткани (ушной выщип, кровь, сперма) от 287 предварительно здоровых особей (коров и быков) айрширской породы семи племенных предприятий РФ, архи- вированные в 2008–2017 годах. Выделение ДНК проводили с помощью наборов «ДНК-Экстран» (ЗАО «Синтол», Россия) и COrDIS (ООО «ГОРДИЗ», Россия) согласно стандартным протоколам производителей с некоторыми нашими модификациями. Подбор праймеров осуществляли с использованием программного обеспечения Primer3web, v. 4.0.0 [53, с. 1] с учетом следующих условий: минимальная, желаемая и максимальная температура отжига – +56, +60 и +64°С, соответственно; минимальное, желаемое и максимальное соотношение GC – 50, 60 и 70%, соответственно; длина фрагмента – 100–350 п.о. Постановку ПЦР осуществляли по методике Н.А. Зиновьевой с соавт. [54, с. 15]. Амплификацию проводили в конечном объеме 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1*ПЦР буфер (16,6 мМ(NH4)2SO4; 67,7 мМ Трис – HCl, pH = 8,8; 0,1 (v/v)Tween 20), 1,5 мМMgCl2, 200мкМ диоксинуклеозидтрифосфатов, 12–15 пмоль каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл тестируемой ДНК (20–50 пмоль/мкл). Продукты АС-ПЦР разделяли посредством электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромида димидия и визуализировали под ультрафиолетовым светом. Для идентификации длин фрагментов использовали молекулярный маркер длины 100 п.о. (500х2) (ООО «Биосан», Россия).

Результаты исследования

Определение полиморфизма гена UBE3B выполняли посредством однопробирочной АС-ПЦР с четырьмя праймерами, в которой праймеры UBE3B-F и UBE3B-R фланкировали общий для двух аллелей фрагмент длиной 329 п.о., а два «внутренних» аллелеспецифических праймера UBE3B-FR и UBE3B-CR2, ориентированные в противоположных направлениях, ам-плифицировали фрагменты, соответствующие аллелям G (236 п.о.) и A (128 п.о.) (рис. А).

A.

12 3 4 56789M

329 п.о. , 236 п.о 128п.о.

Б.

500 п.о.

400 п.о.

300 п.о.

200 п.о.

100п.о.

Рис. Теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма UBE3B на основе АС-ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б)

А: UBE3B-F, UBE3B-R – праймеры, фланкирующие фрагмент; UBE3B-FR и UBE3B-CR2 – внутренние аллелеспецифические праймеры.

Б: дорожка 1 – генотип GA (скрытый носитель AH1); дорожки 2–7, 9 – генотип GG (не носитель AH1); дорожка 8 – отрицательный контроль амплификации (вода); М – маркер (длины «ступеней» маркера в парах оснований (п.о.) указаны справа от фотографии).

* Место исследуемой мутации.

Источник: экспериментальные расчеты и результаты авторов.

Анализ амплифицированных фрагментов в 3% агарозном геле, представленный на электрофореграмме на рис. Б, показывает, что генотипу GG по UBE3B соответствует наличие двух фрагментов длиной 329 и 236 п.о., в то время как генотипу GA – трех фрагментов длиной 329, 236 и 128 п.о. С применением созданной тест-системы исследовано 287 голов крупного рогатого скота – коров и быков айрширской породы, разводимых в четырех регионах Центральной и Северо-Западной России, при этом 240 образцов определено с генотипом GG (не носитель, АН1F) и 47 образцов с генотипом GA (скрытый носитель, AH1C). Генотип АА является летальным и не может быть выявлен среди взрослых животных.

Исследование 259 коров и 28 быков-производителей с использованием разработанной системы выявило наличие 47 скрытых носителей АH1, в том числе 37 коров и 10 быков, что соответствует частотам встречаемости носителей, соответственно,

14,3 и 35,7%, и в среднем по породе составило 16,4%. Быки-производители пяти племпредприятий, носители АН1 гаплотипа, принадлежат в основном линии О.Р. Лихтинг 120135. Ранее было сообщено, что наиболее часто носителями АН1 гаплотипа являются потомки канадских быков Jelyca Oblique, Des Chamois Poker – ET, DEs FLeurs Perfect – ET, De La Plaine Prime, ST Clement Edmour, Kildare Jupiter – ET, Kamouraska Bigstar – ET, Palmyra Bingo – ET, Duo Star Pokerstars, Des Coteaux Warner [55, с. 1; 56].

Полученные нами экспериментальные данные согласуются с результатами H. Venhoranta с соавт. [24, с. 3] по частоте встречаемости носителей АН1 гаплотипа в популяции финских айрширов (17,1%) и занимают промежуточное положение между данными Н.В. Ковалюк с соавт. [57, с. 16] и Null с соавторами [25, с. 1], 10,0 и 22,2%, в популяциях айрширских животных Краснодарского края и США, соответственно. В связи с достаточно высокой частотой встречаемости AH1 в исследованной нами выборке предложенная нами тест-система может быть рекомендована для массового скрининга племенного скота айршир-ской породы в РФ с целью обязательного мониторинга распространения скрытых носителей AH1. В заключение следует отметить, что современные селекционные программы, предусматривающие комби-нативное использование нескольких пород в создании промышленных кроссов, должны не только ориентироваться на эффект гетерозиса в получении желаемого селекционного результата за счет ком- бинации различных генотипов и генетических особенностей исходных пород, но и обращать пристальное внимание на контроль за распространением генетических дефектов, которыми обременены породы, для предотвращения трассирования летальных мутаций в будущие поколения.

Исследования проведены по теме государственного задания, регистрационный номер № АААА-А18-118021590138-1. В исследовании использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста.