Скрининг колоректального рака: прошлое, настоящее, будущее

Принимая во внимание социальный и экономический урон, наносимый поздней диагностикой злокачественных новообразований толстой кишки, в первую очередь, ненаследственной аденокарциномой, предотвращение новых случаев, как и выявление колоректального рака (КРР) на ранних стадиях, является одной из приоритетных задач мирового и национального здравоохранения.

Осознание необходимости превентивной диагностики предраковых заболеваний толстой кишки пришло в практическое здравоохранение не сразу. Фундаментальной предтечей явилась разработка понятия «предрак» с позиций общей патологии и его детальная морфологическая характеристика, начиная с 40х – 50х годов 20-ого века [1].

С момента открытия рентгеновского излучения лучевая диагностика прочно занимала первое место в выявлении как онкологических, так и неонкологических заболеваний толстой кишки. Однако сравнительно большое количество ложно-отрицательных результатов в диагностике полипов и ранних стадий КРР нередко приводило к необходимости проведения колотомии и осмотра слизистой оболочки во время оперативного вмешательства [2]. Данная особенность заставляла исследователей вести поиск других возможностей безопасного осмотра всех отделов толстой кишки.

Несмотря на то, что первый аппарат для осмотра прямой кишки был создан еще в 1806 г. австрийским врачом Филиппом Боззини (который так и не был применен у человека) [3] и множество разработок в данном направлении, осмотреть толстую кишку на всем протяжении удалось только после появления волокно-оптических технологий, обеспечивающих проведение пучка света по непрямолинейной траектории. Это произошло в 1964 г., когда H. Watanabe и соавторы в сотрудничестве с фирмой "Machida" (Япония), на основании уже существующих фиброгастроскопов, разработали первую модель фиброколоноскопа, с помощью которого стала возможна визуальная оценка толстой кишки выше пределов достижимости жесткого ректосигмоидоскопа. В последующем этими и другими авторами созданы усовершенствованные модели первого колоноскопа [4].

Однако только осмотр слизистой оболочки толстой кишки не в полной мере устраивал врачей, и двумя годами позже в 1966 г. H. Niwa с соавторами сообщили о первых результатах использования нового фиброколоноскопа. Данная модель обеспечивала хороший обзор, позволяла брать материал для гистологического и цитологического исследования, фотографировать результаты [5].

В итоге, с 60 – 70-х годов 20-го века эндоскопическое исследование желудочнокишечного тракта начинает активно внедряться в рутинную клиническую практику с лечебно-диагностической целью, но на тот момент «профилактическая» колоноскопия как массовое скрининговое мероприятие не обсуждалась [4, 5].

В то же время с развитием гибкой эндоскопии в практическом здравоохранении появилась возможность визуализации и динамического наблюдения за развитием различных заболеваний толстой кишки и, как результат было четко определено понятие «предрак» с клинико-морфологических позиций.

На современном этапе развития медицинской науки выделены две основные группы заболеваний или состояний, которые рассматриваются «предраком» - наследственные и ненаследственные.

При наследственных предрасполагающих патологиях полностью разработаны скрининговые профилактические и лечебные мероприятия, обозначенные в соответствующих национальных клинических рекомендациях. Однако при ненаследственном КРР группы риска детально не определены и, согласно современным представлениям о предрасполагающих факторах, население старше 50 лет должно подвергаться обязательному скринингу. При этом большинство исследователей указывает, что до 30% ненаследственного КРР имеет, по-видимому, генетическую основу, которая в настоящее время еще не уточнена [6 - 8].

Активный поиск предраковых заболеваний толстой кишки (аденоматозные полипы и хронические воспалительные заболевания) у лиц без отягощенного семейного онкологического анамнеза требует больших затрат ввиду необходимости широкого охвата населения. Несмотря на широкое внедрение эндоскопического исследования органов желудочно-кишечного тракта с лечебно-диагностической целью, кратная пяти или десяти годам, массовая колоноскопия, начиная с возраста 45 - 50 лет, остается непосильным скрининговым мероприятием даже для стран высоким уровнем экономического развития. При этом необходимо учитывать, что риск перфорации толстой кишки колеблется около 0,1 - 0,2% и увеличивается при применении внутривенной анестезии. Таким образом, несмотря на самую высокую точность и специфичность данного метода в выявлении предраковых заболеваний толстой кишки, а также КРР на ранних стадиях, колоноскопия в большинстве стран рекомендуется к применению как метод утоняющей диагностики или в скрининговых программах не чаще чем 1 раз в пять или 10 лет.

Параллельно с развитием эндоскопии внимание исследователей направлено на разработку неинвазивных тестов, которые могли бы ответить на вопросы диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний толстой кишки, особенно, диагностики полипов и злокачественных опухолей на ранних стадиях. Первым среди таких тестов явилось определение скрытой крови в стуле (fecal occult blood test - FOBT). Несмотря на длительность использования и широкую распространенность в мире, чувствительность метода составляет всего 50 – 60% при однократном выполнении. В то же время она может достигать 90%, если исследование проводить один раз в 1 – 2 года в течение длительного периода времени [8 – 10]. Таким образом, начиная с 90-ых годов прошлого века в литературе появилось большое количество публикаций, свидетельствующих о снижении летальности при КРР на 20 – 35% в группах пациентов с регулярным применением FOBT теста. Объяснение этому заключалось в значительном увеличении процента выявления ранних стадий КРР, что, в свою очередь, подразумевало максимально раннее начало лечения подобных пациентов [10].

С учетом низкой специфичности FOBT разработан иммунохимической метод определения человеческого гемоглобина в кале (iFOBT). Преимущество iFOBT над FOBT, заключается в том, что он не обнаруживает гемоглобин животных и частично переваренный гемоглобин человека из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что позволяет дифференцировать источник потери крови [11]. При обобщени результатов исследований чувствительность и специфичность данного теста колеблется в пределах 80 – 90% для КРР и 60 – 90% для дргуих, клинически значимых неоплазий [12, 13]. Таким образом, существенного превосходства iFOBT над FOBT не выявлено. В то же время значительно большая стоимость иммунохимического исследования привела к тому, что оно практически не используется для массового скрининга КРР [13].

С целью улучшения скрининговых методов в настоящее время прилагаются значительные усилия для выявления специфических маркеров КРР в кале [14]. Данные ряда клинических исследований по определению ДНК-маркеров в образцах кала и крови указывают на их пригодность для ранней диагностики КРР, а развитие технологий постоянно повышает их чувствительность и специфичность в диагностике как доброкачественных предраковых заболеваний, так и КРР на ранней стадии [9, 15, 16].

Одним из самых перспективных направлений ранней диагностики КРР являются политаргетные ДНК-тесты. Увеличение количества исследуемых генов сопровождается повышением чувствительности и специфичности данных тест-систем. В то же время, если чувствительность обнаружения КРР при подобном тестировании составляет более 90%, то при обнаружении полипов с дисплазией высокой степени – не более 70%. Специфичность тестирования при использовании политаргетных ДНК-тестов колеблется в пределах 80 – 90% [17, 18].

Существенным недостатком данного метода является необходимость выявления «сверхмалого» количества ДНК «субстрата болезни» – поврежденных колоноцитов в кале на фоне многократно превышающего количества другого генетического материала и, прежде всего, микрофлоры кишечника. В то же время некоторые метаболиты, такие как соли желчных кислот, продукты распада гемоглобина и сложные полисахариды, которые в большом количестве содержатся в кале, могут выступать в качестве ингибиторов полимеразной цепной реакции, что необходимо постоянно преодолевать [19]. Безусловно, постоянное развитие технологий получения и обработки материала повышает его чувствительность и специфичность в диагностике как доброкачественных, так и злокачественных опухолей, но параллельно повышается и его стоимость, делая это исследование, с одной стороны, высокоэффективным методом диагностики КРР, с другой – весьма дорогостоящим и не подходящим для применения в качестве скринингового теста [20].

В настоящее временя отсутствует единая унифицированная программа по ранней диагностике КРР, и в большинстве экономически развитых стран используются национальные алгоритмы. При этом подавляющее число исследователей отмечают необходимость разработки и внедрения новых методов скрининга, предусматривающих выявление молекулярных маркеров ранних (доморфологических) стадий опухолевого процесса [21].

С учетом фундаментальных данных об опухолевом процессе, сформированных в результате комплексного анализа и синтеза результатов исследований канцерогенеза середины и конца прошлого столетия, становится очевидной недостаточность изучения собственно опухоли и формирование программ скрининга на основании выявления только неопластического субстрата, к которым можно отнести выявление опухолевых клеток или крови в стуле или же поиск маркеров опухолевого роста в плазме крови. Подобный подход заведомо ставит исследователей в статус «догоняющего» и не может обеспечить основную цель – снижение заболеваемости КРР за счет лечения предраковых заболеваний [22, 23].

Таким образом, многие авторы считают, что к изучению процесса злокачественной трансформации тканей необходимо подходить с позиций системности развивающихся отклонений. Неопластический рост сопровождается изменением функции различных органов: в первую очередь нейроэндокринной и иммунной систем, которые, предположительно, могут происходить задолго до формирования морфологически выявляемой опухоли. Длительно воздействующие системные отклонения нейроэндокринной регуляции и иммунологического надзора в совокупности с локальными факторами, в том числе кишечной микробиотой, обеспечивают направленный отбор и дифференцировку клеток слизистой оболочки толстой кишки, отличающихся по протеомному профилю и экспрессии генов от нормы. Формируемые молекулярные особенности в течение длительного времени остаются недоступными не только эндоскопическому, но и морфологическому методам исследования, а по ряду генов - и ДНК-тестированию ввиду отсутствия изменения нуклеотидных последовательностей [22 - 26].

Вышеперечисленные характеристики раннего канцерогенеза подтолкнули нас к проведению исследования слизистой оболочки толстой кишки без морфологических признаков опухолевого роста у пациентов с верифицированным КРР. Для этого мы исследовали уровни экспрессии 62 генов (Табл. 1) на основании определения их мРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, в слизистой оболочке толстой кишки, удаленной от самой опухоли на расстояние не менее 15 см, у 129 пациентов с различными стадиями КРР. Группой сравнения явились образцы слизистой оболочки толстой кишки здоровых добровольцев без каких-либо онкологических заболеваний и другой патологии толстой кишки по данным колоноскопии. На первом этапе исследования проведен простой сравнительный анализ по уровню экспрессии каждого изучаемого гена в группах. Нами отмечено, что уровень экспрессии только 5 из 62 генов не отличают изучаемые группы между собой, что не позволяет характеризовать слизистую оболочку толстой кишки без морфологических признаков опухолевого роста у больных КРР («фоновая» слизистая оболочка») как нормальную, а уровень экспрессии генов как физиологический. Таким образом, «фоновая» слизистая оболочка не может использоваться в качестве контрольных образцов для оценки отличительных особенностей опухолевой ткани от нормальной. Выявленная особенность ставит под сомнение доминировавшую на протяжении последнего полувека трактовку различных морфологических и молекулярно -биологических данных, которая основывалась на поиске различий между «фоновой» слизистой оболочкой и первичной опухолью, а данные различия объяснялись нарастанием молекулярно-генетических событий в морфологическом субстрате опухоли, что позволяло продолжать поиски средств «подавления» повышенной пролиферации, ангиогенеза и т.д.

Таблица 1. Группы генов, включённых в исследование*

Группа (по доминирующей функции)	Гены
Апоптоз	BCL2, BAX, BAG1, NDRG1, BIRC5 (SURVIVIN), TERT
Пролиферация	Ki-67, CCND1, CCNB1, PTEN, STK-15(AURKA), P16INK4A, P14ARF
Транскрипция	MYC, MYBL2
Факторы роста	VEGFа 121, VEGFа 165, VEGFа 189, SCUBE2, IGF-1, IGF- 2, TGF-b
Дифференцировка	ESR, PGR, CYP19, C-erbB2, GRB7, СD45, СD56, CD68
Многофункциональные гены	СD56(N-CAM-1), LIF, LIFR
Межклеточные взаимодействия	MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, ММР11, CTSL2, PAPPA
Цитокины   и   факторы иммунного ответа	IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10,  IL-12α, IL-15; СOX-2, TNF-α, TLR-2, TLR-4, TLR-7, IFN-g, GNLY, HLA-G1, HLA- G5, LIF, LIFR, LGALS1, GATA3
Референсные гены	GUSB, B2M, HPRT

*некоторые гены указаны более, чем в одной группе

Между тем, полученные молекулярно-генетические характеристики «фоновой» слизистой оболочки позволяют рассматривать ее как непосредственного участника системного процесса неопластической трансформации, играющего роль не только источника первичного рекрутирования генетически трансформированных клеток, но и активного динамического микроокружения морфологического опухолевого субстрата [26 – 28].

Далее мы проанализировали возможность идентификации образцов на основании определения профиля исследованных генов. Для этого мы использовали дискриминантный анализ, на основании которого, нам удалось с 99% вероятностью получить отличия «фоновой» слизистой оболочки толстой кишки у больных КРР и слизистой оболочки толстой кишки здоровых добровольцев. Результат представлен в таблице 2.

оболочки толстой кишки у пациентов КРР

Гены	Wilks'	p-level
HLA-G1	0,198571	0,000146
IL6	0,202955	0,000024
TNFα	0,198909	0,000127
NDRG1	0,220122	0,000000
CD68	0,194927	0,000695
P16INK4A	0,196958	0,000290
LGALS1	0,220042	0,000000
PTEN	0,191970	0,002565
MYBL2	0,189563	0,007681

Таблица 2. Значение лямбды Уилкса и уровень статистической значимости для генов, включенных в уравнение дискриминантной функции для морфологически неизмененной слизистой оболочки здоровых добровольцев и морфологически неизмененной слизистой

Гены	Wilks'	p-level
KI67	0,196100	0,000419
VEGFA121	0,193560	0,001265
CCNB1	0,189477	0,007994
IL8	0,199422	0,000102
COX-2	0,189642	0,007404
VEGFA189	0,191071	0,003846
MMP11	0,195039	0,000662
ESR1	0,195289	0,000594
CTSL2	0,191872	0,002680

На основании проведенного дискриминантного анализа «фоновую» слизистую оболочку толстой кишки больных КРР возможно отличить от слизистой оболочки толстой кишки здоровых лиц практически в 100% наблюдений при оценке экспрессии 18 генов (Табл. 3).

Таблица 3. Степень совпадения клинико-морфологической и полученной, согласно данным дискриминантной функции, классификации для морфологически неизмененной слизистой оболочки здоровых добровольцев и морфологически неизмененной слизистой оболочки толстой кишки у пациентов КРР

Группы сравнения	%	Слизистая   здоровых добровольцев	Слизистая пациентов КРР
Слизистая       здоровых добровольцев	98,0000	49	1
Слизистая пациентов КРР	100,0000	0	129
Total	99,4413	49	130

Учитывая, что основной вклад в данную классификацию могли внести образцы с III и

IV стадиями колоректального рака, на втором этапе исследования в отдельную подгруппу основной группы, мы выделили образцы с только I стадией заболевания (25 человек). Результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4. Значение лямбды Уилкса и уровень статистической значимости для генов, включенных в уравнение дискриминантной функции для морфологически неизмененной слизистой оболочки здоровых добровольцев и морфологически неизмененной слизистой оболочки толстой кишки у пациентов КРР при I стадии заболевания

Гены	Wilks'	p-level
IFNg	0,133372	0,004056
IL8	0,151993	0,000005

Гены	Wilks'	p-level
IL6	0,153570	0,000003
TERT	0,136322	0,001296

Таблица 5. Степень совпадения клинико-морфологической и полученной, согласно данным дискриминантной функции, классификации для морфологически неизмененной слизистой оболочки здоровых добровольцев и морфологически неизмененной слизистой оболочки толстой кишки у пациентов КРР при первой стадии заболевания

Группы сравнения	%	Слизистая   здоровых добровольцев	Слизистая пациентов КРР
Слизистая       здоровых добровольцев	100,0000	50	0
Слизистая пациентов КРР	96,0000	1	24
Total	98,6666	51	24

IL15	0,160791	0,000000
NDRG1	0,156048	0,000001
CD68	0,138806	0,000512
BAG1	0,144898	0,000058
TNFα	0,132440	0,005871
STK15	0,128737	0,027159
KI67	0,186298	0,000000
CCNB1	0,168980	0,000000

CCND1	0,142432	0,000137
GRB7	0,144778	0,000060
P16INK4A	0,135113	0,002057
MYBL2	0,133913	0,003278
BIRC5	0,129560	0,019129
PTEN	0,130277	0,014172
SCUBE2	0,138973	0,000481
IL10	0,131420	0,008860

Таким образом, дискриминантный анализ позволил с вероятностью 98,67% отличить слизистую оболочку здоровых лиц от больных КРР I стадии. В нашем исследовании для этого потребовалась оценка экспрессии 20-ти генов.

С учетом значительных изменений уровней экспрессии изученных генов в слизистой оболочке толстой кишки больных КРР возможно обоснованно утверждать о выраженном нарушении всех основных процессов, ответственных за поддержание гомеостаза и нормального функционирования органа при ее злокачественном поражении. При этом изменения, выявленные при I стадии КРР, говорят о том, что опухоль существует на фоне значительных отклонений экспрессии многих генов, которые могут быть определены на ранних стадиях канцерогенеза. Важной полученной особенностью является то, что молекулярная основа измененной экспрессии генов (эпигенетическая регуляция или мутация на фоне полиморфных особенностей генотипа) не имеет принципиального значения для диагностики – выделения группы риска с целью дальнейшего эндоскопического и морфологического исследования.

Учитывая социальную значимость и вклад в снижение продолжительности жизни онкологических заболеваний, комплекс мероприятий, направленный на выявление предраковых заболеваний и ранних стадий рака толстой кишки является одним из важнейших направлений онкологии. Для достижения указанной цели в настоящее время разработано большое количество различных скрининговых программ, однако, данные мероприятия направлены не на снижение заболеваемости, а на раннее выявление опухоли.

Ввиду этого, следующим этапом проводимого исследования мы рассматриваем поиск маркеров, которые моги бы отличить слизистую оболочку здоровых добровольцев и слизистую оболочку толстой кишки у пациентов с морфологически верифицированным предраком толстой кишки. Параллельно для создания диагностической панели неинвазивного скрининга предрака и ранних стадий КРР (с потенциальным уменьшением количества необходимых генов без снижения чувствительности и специфичности), требуется увеличение количества наблюдений и оценка воспроизводимости данной методики в клеточном материале мазков из прямой кишки. Поиск и выявление именно таких изменений на молекулярном уровне сможет поспособствовать достижению основной практической цели онкологов и системы здравоохранения в целом – снижения заболеваемости онкологическими заболеваниями и, в частности, аденокарциномой толстой кишки.