Снижение токсичности кормов с использованием бактериальных изолятов

В условиях интенсивного развития животноводства актуальной является проблема санитарного качества кормов. Изначально главную роль играет нарушение технологии заготовки и хранения кормовой массы, в результате чего обнаруживают низкие показатели эффективности ведения животноводства [9, 13]. К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека и животных, относятся микотоксины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них иммунодепрессивных, патогенных и канцерогенных свойств [3, 6]. Данные литературных источников свидетельствуют о значительной частоте и степени поражения кормов и пищевых продуктов микотоксинами во всех странах мира [10, 11]. В России, в том числе и в Татарстане, по степени распространенности наибольшее значение имеют микромицеты рода Fusarium и фу-зариотоксины – Т-2 токсин, дезоксинива-ленол и зеараленон [7].

Существует множество методов детоксикации кормов от микотоксинов: химические, физические, биологические и комбинированные. Однако большинство физических и химических методов детоксикации дорогостоящие, требуют определенных производственных затрат, влияют на показатели качества кормов и незначительно снижают количество микотоксинов. Биологические способы детоксикации предусматривают применение ферментных препаратов и микроорганизмов, ингиби- рующих развитие продуцентов микотоксинов в желудочно-кишечном тракте животных или выделяющих ферменты, деструктурирующие микотоксины [4, 8, 12]. Изыскание наиболее эффективных методов и средств, способствующих максимальному обезвреживанию микотоксинов в кормах, является на данный момент одной из актуальных задач [2].

Целью настоящего исследования явилась экспериментальная оценка степени влияния микроорганизмов на общую токсичность комбикорма.

Материал и методы исследований. Опыты проводили в условиях отделения токсикологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В экспериментах использовали культуры микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacte-rium freudenreichii и Bacillus subtilis, выделенные из природных биотопов. Для проведения исследований по оценке эффективности их применения в целях снижения токсичности кормов растительного происхождения изготавливали кормовые гранулы из доброкачественного комбикорма и фунгальной массы на основе зерна пшеницы, содержащей метаболиты штаммов микромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus. Предварительно оценивали общую токсичность комбикорма и зерна в соответствии с ГОСТ 31674-2012 [1], корма были признаны нетоксичными. Затем культивировали микромицеты в течение 14 суток в жидкой картофельной среде в качалочной колбе в условиях аэрации при скорости вращения 120 об./мин и температуре 26 0С. Для приготовления фунгальной массы навески промытого зерна помещали в стеклянные флаконы, добавляли дистиллированной воды из расчета 10 мл на 100 г зерна, тщательно перемешивали, выдерживали 1 ч при частом встряхивании и автоклавировали при 121 0С в течение 30 минут. После остужения до комнатной температуры зерно контаминировали суспензией микроскопических грибов каждым штаммов в отдельности в концентрации 1×107 спор/мл, тщательно перемешивали. Флаконы помещали в термостат, культивирование микромицетов проводили при температуре 26 0С. Во всех емкостях отмечен рост мицелия, спустя 20 суток содержимое емкостей автоклавировали (при давлении 1 атм., 30 минут), просушивали при 45 0С, размалывали на лабораторной мельнице и перемешивали.

Биотестированием на простейших (Stylonychia mytilus) и кроликах-альбиносах, в остром опыте – на белых крысах, установили токсичность полученной массы (отмечены высокая гибель простейших (выживаемость при исследовании водного раствора ацетонового экстракта составила 28,66±3,29 %, водного экстракта – 70,84±1,66 %), воспалительный процесс у кроликов на обработанном участке кожи, падеж крыс). Затем даную массу смешивали с комбикормом в пропорции 1:100, увлажняли, из полученной смеси формировали гранулы посредством пропускания массы через бытовую мясорубку, подсушивали их в сушильном шкафу при температуре 500С в течение 8 часов.

Культивирование бактериальных штаммов проводили в жидких питательных средах: молочно- и пропионовокислых – в модифицированной сывороточной среде в условиях термостата при 30 0С в течение 24 ч., Bacillus subtilis – в мясопептонном бульоне, при 37 0С, 72 ч. Концентрацию микробных клеток в суспензиях оценивали методом высева последовательных серийных десятикратных разведений на плотные питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Затем клеточную суспензию каждого из изолятов вносили в навески полученного токсичного корма до получения конечного титра микроорганизмов 5x1012 КОЕ/кг, в качестве контроля использовали адекватное количество физиологического раствора. Массу тщательно перемешивали и подсушивали на воздухе. Корм хранили в картонных коробках в прохладном помещении.

Биотестирование проб изготовленного гранулированного корма и обработанного суспензиями микроорганизмов проводили путем извлечения из них различных фракций токсических веществ ацетоном с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий, кроликов (кожная проба) и мышей (острый опыт) [1].

Изучение эффективности отобранных микроорганизмов по снижению токсичности корма при длительном скармливании было проведено на белых крысах, результаты оценивали по анализу интегральных и клинико-гематологических показателей. Опыт проводили на 36 беспородных белых крысах, живой массой 130150 г, разделенных на 6 групп, по 6 голов в каждой (время адаптации перед началом эксперимента составляло не менее 14 дней). Первая группа служила отрицательным контролем и получала в течение 21 суток нетоксичный корм, животные второй группы (положительный контроль) – токсичный (гранулы, контаминированные метаболитами микроскопических плесневых грибов). Крысам 3-6 групп скармливали токсичный корм, обработанный суспензией микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis, соответственно (с титром 5x1012 КОЕ/кг корма). Все животные находились в одинаковых условиях содержания, соответствующих зоогигиеническим нормам, имели свободный доступ к кормам согласно суточным нормам, водопой был без ограничений. В начале опыта осуществляли взвешивание крыс, забор и анализ крови общепринятыми методами [5].

На протяжении всего эксперимента проводили оценку поедаемости кормов и каждые 7 дней – анализ динамики живой массы. На 21 сутки опыта всех животных подвергали убою, отбирали и исследовали пробы крови, оценивали состояние внутренних органов.

Статистическую обработку полученного цифрового материала осуществляли методом вариационной статистики с применением программы Microsoft Excel.

Результаты исследований. При проведении биотестирования проб корма на стилонихиях установлено, что выживаемость простейших при исследовании водного раствора ацетонового экстракта токсичного корма была ниже в сравнении с контрольным образцом на 49,4 %, обработка же его суспензией микроорганизмов способствовала снижению токсичности (Таблица 1).

Таблица 1 – Токсичность корма, обработанного суспензией изолятов микроорганизмов, на простейших Stylonychia mytilus

Проба корма	Выживаемость простейших, %
К	92,24±1,50*
ТК	42,84±2,63
ТК+Lactobacillus plantarum	73,14±1,97*
ТК+Lactococcus lactis	70,50±1,55*
ТК+Propionibacterium freudenreichii	74,04±2,11*
ТК+Bacillus subtilis	74,40±0,84*

Примечание: К – корм, ТК – токсичный корм * – различия с ТК достоверны с точностью P ≤ 0,05

Обработка суспензией Lactococcus lactis достоверно повышала выживаемость стилонихий на 27,7 %, Lactobacillus plantarum, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis – на 30,3; 31,2 и 31,6 %, соответственно.

Исследование на кроликах и мышах позволило учесть дермонекротическое действие веществ корма и их воздействие на пищеварительную систему животных. Было установлено, что двукратное накожное нанесение с последующим втиранием масляного раствора ацетонового экстракта контрольного образца корма не вызывало каких-либо изменений. При исследовании проб токсичного корма отмечены гиперемия, точечные кровоизлияния, уплотнение, болезненность и шелушение кожи. Нанесение на выстриженные участки кожи кролика экстрактов корма, обработанного суспензиями микроорганизмов способствовало появлению гиперемии, сохраняющейся не более 1-2 суток, другие признаки воспалительной реакции отсутствовали.

Однократное пероральное введение белым мышам (по 0,5 мл) масляного раствора ацетонового экстракта контрольного образца корма и обработанного суспензиями исследуемых бактерий, не вызывало изменений в клиническом статусе в тече- ние 3 суток наблюдения, при вскрытии убитых животных патологий внутренних органов обнаружено не было. Мыши, получавшие экстракт токсичного корма, были угнетены, отмечена гибель 2 из 5 голов, при вскрытии павших и вынужденно убитых животных были выявлены кровоизлияния в паренхиматозных органах, геморрагическое воспаление желудочнокишечного тракта.

В хроническом опыте в ходе наблюдения за клиническим состоянием белых крыс было установлено, что животные первой группы и потреблявшие токсичные гранулы, обработанные суспензией бактерий, были активными, свободно потребляли корм и воду.

Крысы второй группы поедали корм не охотно и не полностью, были угнетены, с 12-15 суток опыта наблюдалось расстройство желудочно-кишечного тракта в виде диареи. Как следует из данных, представленных в таблице 2, масса тела животных, потреблявших нетоксичные гранулы, за время опыта увеличилась на 28,6 %, средний суточный привес составил 1,94 г. У крыс, получавших токсичный корм, прирост массы составил, соответственно, 14,8 % и 1,00 г, что достоверно ниже контроля на 52,0 %.

Таблица 2 – Динамика массы тела белых крыс, потреблявших токсичные корма, обработан- ные суспензией изолятов микроорганизмов

Группа	Живая масса, г				Прирост массы за опыт, г
	фон	7 сут	14 сут	21 сут
1	142,33±3,35	155,17±3,49	169,00±3,12	183,00±3,15	40,67
2	142,67±2,29	153,67±2,20	160,17±2,39*	163,83±1,75*	21,16
3	140,67±2,33	151,83±2,41	165,67±1,93	178,33±2,01	37,66
4	142,83±2,99	154,83±2,32	167,17±2,20	179,83±1,71	37,00
5	141,17±2,36	153,33±2,20	167,83±1,83	181,17±1,84	40,00
6	140,60±2,50	152,00±2,15	166,67±2,33	180,00±2,00	39,40

* - различия с контролем достоверны с точностью p ≤ 0,05

Добавление в токсичный корм суспензии микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacte-rium freudenreichii и Bacillus subtilis с титром 5x1012 КОЕ/кг корма оказывало протекторное воздействие на организм, масса тела животных, потреблявших его, не имела достоверных отличий с контролем. Так, прирост массы у крыс третьей группы на 80 % превысил прирост животных, поедавших токсичные гранулы, у крыс четвертой – на 74,9 %, пятой и шестой групп – на 89,0 и 86,2 %, соответственно. Среднесуточный привес массы у животных 3-6 групп составил 1,79; 1,76; 1,90 и 1,88 г, что ниже контроля на 7,4; 9,0; 1,6 и 3,1 %, со- ответственно.

Результаты исследования крови подопытных животных свидетельствовали о нормализации обменных процессов на фоне обработки токсичного корма бактериальной суспензией (Таблица 3). Так у крыс, потреблявших токсичные гранулы, на 21 сутки опыта отмечены изменения картины крови, характеризующиеся достоверным снижением содержания эритроцитов и концентрации в них гемоглобина на 16,7 и 17,5 %, соответственно, повышением уровня лейкоцитов на 7 %, что обусловлено угнетением гемопоэза и воспалительными процессами, происходящими в организме.

Таблица 3 – Гематологические показатели белых крыс, потреблявших токсичные корма, об- работанные суспензией изолятов микроорганизмов

Группа	Эритроциты, 1012/л	Лейкоциты, 109/л	Гемоглобин, г/л
фон	6,48±0,07	8,17±0,20	144,13±3,01
1	6,58±0,10	8,53±0,15	154,00±2,00
2	5,48±0,14*	9,13±0,14*	127,05±2,00*
3	6,38±0,20	8,28±0,27	146,83±2,66
4	6,43±0,16	8,33±0,24	149,30±2,85
5	6,40±0,15	8,57±0,26	150,65±2,05
6	6,41±0,19	8,27±0,21	149,17±2,00

* - различия с контролем достоверны с точностью p ≤ 0,05

В крови животных, которые потребляли корм, контаминированный метаболитами микромицетов и обработанный суспензией испытуемых микроорганизмов, выявлено незначительное снижение исследуемых показателей, отличия с контрольными значениями были недостоверными.

Заключение. Биотестированием на простейших, кроликах и мышах было установлено снижение токсичности корма, контаминированного метаболитами мик-ромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus и обработанного суспензиями бактерий Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Pro-pionibacterium freudenreichii и Bacillus sub-tilis. При длительном скармливании токсичного корма, предварительно обработанного исследуемыми микроорганизмами, отмечено их протекторное воздействие на организм подопытных животных. Следовательно, штаммы обладают способностью к детоксикации токсичных метаболитов микроскопических грибов и потенциально могут быть использованы с целью повышения доброкачественности кормов растительного происхождения.

Работа выполнена при поддержке Совета по грантам Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых и по государственной поддержке ведущих научных школ РФ в рамках выполнения гранта МК-1582.2020.11 (соглашение №   075-15-2020-225 от

27.04.2020).

Резюме

В статье представлены результаты оценки степени влияния микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis на общую токсичность комбикорма. Для проведения исследований изготавливали кормовые гранулы из доброкачественного комбикорма и фунгальной массы на основе зерна пшеницы, содержащей метаболиты штаммов микромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus. Биотестирование проб изготовленного гранулированного корма и обработанного суспензиями микроорганизмов проводили путем извлечения из них различных фракций токсических веществ ацетоном с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий, кроликов (кожная проба) и мышей. Изучение эффективности отобранных микроорганизмов по снижению токсичности корма при длительном скармливании было проведено на белых крысах, результаты оценивали по анализу интегральных и клинико-гематологических показателей. Установлено, что штаммы обладают способностью к детоксикации токсичных метаболитов микроскопических грибов и потенциально могут быть использованы с целью повышения доброкачественности кормов растительного происхождения.