Сонохимический подход получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с высоким содержанием эргостерола

Эргостерол – самый распространенный природный липидный компонент в мембранах грибов. Эргостерол играет важную биологическую роль в росте клеток, поддержании и регуляции мембран, контроле клеточного цикла. Для организма человека эргостерол важен тем, что является предшественником витамина D2, который играет ключевую роль в регуляции обмена кальция и фосфора, в поддержании здоровья костей [2–4, 7, 9, 11, 15, 18, 19].

Одним из потенциальных источников эргостерола могут выступать микроорганизмы, активно используемые в пищевых производствах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются наиболее изученными и востребованными в пищевой отрасли микроорганизмами. Многие первичные и вторичные метаболиты клеток дрожжей могут представлять интерес с точки зрения их полезности для организма человека, что делает биомассу дрожжей привлекательным ингредиентом для производства продуктов питания с улучшенной пищевой ценностью. Дрожжи относительно легко культивировать и концентрировать из-за достаточно большого размера их клеток, а производство их биомассы является экологически чистым, не требуя значительных затрат воды и не выделяя много парниковых газов, особенно при условии аэробного культивирования [12].

В литературе имеются исследования, подтверждающие, что под воздействием ультрафиолетового света в диапазоне длин волн 248–260 нм эргостерол в биомассе дрожжей способен превращается в витамин D2 [2, 7, 18].

Важно отметить, что интенсивность биосинтеза эргостерола дрожжами Saccharomyces cerevisiae во многом зависит от штамма дрожжей, условий культивирования и способов дополнительных воздействий, включая стрессовые факторы. При получении биологически активных веществ с применением биотехнологических подходов в коммерческих целях приоритет направлен на минимизацию затрат культивирования при условии высокой эффективности и устойчивости процесса [3–5].

Известно, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются факультативно-анаэроб ными организмами. Они способны реагировать на наличие кислорода во внешней среде, используя как окислительный, так и ферментативный метаболический режим, и могут давать существенный прирост биомассы, даже когда аэробное дыхание ограничено или полностью отсутствует [1, 19].

Вместе с тем метаболическая реакция на наличие кислорода ведет к изменениям внутриклеточных потоков, которые в целом опосредованы транскрипционной, белковой и метаболической регуляцией, а сами внутриклеточные потоки являются интегрированной сетевой реакцией на регулируемые взаимодействия между ферментами и метаболитами [7, 9].

Научные исследования, представленные в литературе, показывают, что кислород является ключевым фактором, определяющим синтез эргостерола в дрожжевой клетке, который включает три ключевых этапа: биосинтез мевалоната, биосинтез фарнезилпирофосфата и биосинтез эргостерола. Известно, что одна из важнейших функций эргостерола в клетке дрожжей – это участие в формировании механических свойств мембраны, обеспечивая за- щитные свойства от внешних факторов. Поэтому одним из направлений интенсификации процессов биосинтеза эргостерола дрожжами является использование различных видов стрессовых воздействий.

В качестве фактора, формирующего стрессовые условия для дрожжей и потенциально способствующего увеличению содержания растворенного кислорода в питательной среде, в настоящем исследовании использовалось ультразвуковое воздействие частотой (22 ± 2) кГц.

Цель исследования – это оценка возможности использования сонохимической стимуляции синтеза эргостерола дрожжами Saccharomyces cerevisiae .

Материалы и методы исследования

Для экспериментальных исследований был взят коммерчески доступный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae – дрожжи WB-1015.

Для культивирования дрожжей использовалось питательная среда YPD: дрожжевой экстракт (5 г/л), пептон (10 г/л) и декстроза (20 г/л). Стерилизация 30 мин.

Культивирование всех образцов вели в строго аэробных условиях в течение 8 часов в минибиореакторе пробирочного RTS-1 при температуре 33 °С, скорости перемешивания 1000 об/мин и реверсе 10 с. Дрожжи вносили в сухом виде в количестве 1 об. % к объему питательной среды.

На первом этапе исследований был проведен общий скрининг дрожжевых культур с использованием микроскопических методов анализа и приготовления неокрашенного препарата дрожжевой культуры и окрашенных препаратов (раствором Люголя и метиленовым синим).

Для установления влияния ультразвукового воздействия (УЗВ) на количество растворенного кислорода питательную среду обрабатывали в 9 разных режимах сочетания мощности и времени воздействия:

– мощность: 120, 240 и 360 Вт;

• –    время: 1, 5 и 9 мин.

Содержание кислорода определяли с помощью анализатора растворенного кислорода Leminfu-2. По результатам анализа была проведена процедура оптимизации режимов УЗВ с применением двухфакторного регрессионного анализа.

Дрожжи культивировали в контрольной питательной среде (без использования каких- либо видов обработки) и в питательной среде после обработки ультразвуком в установленном режиме (обработку вели после внесения дрожжевой культуры). В исходной биомассе дрожжей и полученных при культивировании в среде YPD и YPD-УЗВ определяли содержание эргостерина спектрофотометрически.

Экстракцию стеринов проводили с использованием 70 % раствора этанола. Расчет количественного содержания искомого вещества определяли по оптической плотности в концентрированной серной кислоте при аналитической длине волны спектрофотометра 328 нм. Пересчет проводили на эргостерол. Оптическую плотность измеряли сразу после приготовления раствора.

Все исследования проводились в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований проводили по методу Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Для эффективного протекания процессов биосинтеза к состоянию дрожжевой культуры предъявляется ряд требований, в том числе контролируется физиологическое состояние клеток дрожжей: количество почкующихся клеток, мертвых клеток, содержание в дрожжах запасных питательных веществ (гликогена и волютина), а также наличие посторонних микроорганизмов [1, 3, 13].

Результаты микроскопии исследуемых образцов дрожжей наглядно отражены на рис. 1.

Оценка жизнеспособности и физиологического состояния исследуемых образцов дрожжей показала, что культура дрожжей имеет характерный вид клеток овальной формы. В полях зрения просматриваются почкующиеся клетки и клетки с родовыми шрамами. Окраска раствором Люголя показала, что процент зрелых клеток достаточно высок. Микроскопия с окраской метиленовым синим позволила установить достаточно высокое количество мертвых клеток в образце дрожжей – около 16 %. В совокупности же можно отметить, что исследуемый образец дрожжей является приемлемым для культивирования.

На следующем этапе исследований оценивали влияние ультразвуковой обработки питательной среды на количество растворенного кислорода (результаты представлены в таблице).

При проведении оптимизации режимов УЗВ была получена поверхность отклика и установлены оптимальные режимы УЗВ (рис. 2), позволяющие увеличить количество растворенного кислорода в питательной среде в 1,3 раза в сравнении с контролем.

Содержание растворенного кислорода в питательной среде, мг/л

Время обработки, мин	Мощность воздействия, Вт
	120	240	360
1	7,9	7,6	5,4
3	7,4	8,7	4,5
5	7,1	4,0	4,2

Неокрашенный препарат

Окраска раствором Люголя

Окраска метиленовым синим

Рис. 1. Результаты микроскопии дрожжей (препарат «раздавленная капля», увеличение × 720)

Но основании полученных результатов с применением программного продукта MathCad была получена зависимость количества растворенного кислорода от режимов обработки ультразвуком (рис. 2).

вировании в питательной среде без обработки ультразвуком.

Зависимость распределения метаболических процессов Saccharomyces cerevisiae от наличия и концентрации кислорода представ-

Y = 2,61X 1 ² +7,249×10^-4 X 2 ²+0,031 X 1 X 2 +17,571 X 1 +0,363 X 2 +14,762

Рис. 2. Зависимость количества растворенного кислорода от режимов обработки ультразвуком

Культуры дрожжей в питательной среде YPD были обработаны в течение 2 мин при мощности воздействия 120 Вт, что наиболее близко к оптимальным режимам с учетом технической возможности прибора.

Результаты определения эргостерола в исследуемых образцах дрожжей перед началом культивирования и после культивирования в течение 8 часов в обработанной ультразвуком питательной среде и в необработанной представлены на рис. 3. Установлено, что исследуемые образцы дрожжей в исходном виде содержат эргостерол в количествах, достигающих (9,4 ± 0,2) мг% в пересчете на сухое вещество.

После культивирования в биомассе дрожжей, подвергнутой УЗ-воздействию, значение содержания эргостерола достигало 10,9 и 13,2 мг%, что в 1,21 выше, чем при культи- ляет большой интерес для многих биотехнологических применений Saccharomyces cerevisiae [2, 8, 13, 17].

При аэробном росте кислород служит конечным акцептором электронов при дыхании. Когда доступность кислорода ограничена, клеткам нужны альтернативные акцепторы электронов НАДН и ФАДН2 для поддержания окислительно-восстановительного баланса. В аэробных условиях ассимиляционный НАДН окисляется в основном внешними НАДН-дегидрогеназами или транспортируется в митохондрии с помощью глицерол-3-фосфатного челнока, тогда как в отсутствие кислорода Saccharomyces cerevisiae производит глицерин в качестве окислительновосстановительного стока [6, 8, 10]. Окислительный стресс, которому подвергаются клетки при высокой концентрации кислорода во

Рис. 3. Содержание эргостерола в биомассе образцов дрожжей в пересчете на сухое вещество, %

внешней среде, создаёт другие проблемы, связанные с окислительно-восстановительными реакциями. Ключевым для наших исследованиях является понимание того, что кислород – это важный реагент в биосинтезе стеролов и реакциях анаболической десатурации [14, 16].

Выводы

Таким образом, проведенные исследования показали пригодность использования дрожжей Saccharomyces cerevisiae для полу- чения эргостерола. Однако этот процесс требует существенной доработки для интенсификации биосинтеза этого метаболита, например, с применением ультразвукового воздействия. В отношении ультразвука следует продолжить исследования для более глубокого понимания возможных механизмов его влияния на накопление эргостерола дрожжевой клеткой. Эти направления и составляют основу будущих исследований.