Состояние процессов свободно-радикального окисления при термической травме разной степени тяжести

При термических травмах возникают благоприятные патофизиологические и биохимические условия для ускорения процессов свободно-радикального окисления. К ним относятся - гипоксия, активация клеток воспаления и гемостаза, возрастание функции органов детоксикации, усиление липолиза и повышение содержания в крови жирных кислот, истощение систем антиоксидантной защиты [2,4, 8, 11, 13, 14].

В то же время в ряде публикаций указывается на снижение интенсивности данного процесса из-за повышенного расхода жирных кислот, в первую очередь полиненасыщенных, понижения «окис-ляемости» липидов, угнетающего влияния ряда биохимических компонентов ожоговой токсемии, таких как фракции средних молекул (молекулярной массой от 1000 до 5000 дальтон), холестерина, мочевины, билирубина и других [1, 12, 15, 16].

Изменения характера и интенсивности свободно-радикального окисления могут зависеть от стадии и тяжести ожоговой болезни.

Целью исследования было определение интенсивности свободно-радикального окисления при термической травме (стадии ожогового шока и ожоговой токсемии) разной степени тяжести.

Методы исследования

Термическую травму вызывали под эфирным наркозом у взрослых белых крыс массой 150—200 г погружением эпилированной спинки на 1-3 секунды в кипящую воду. Животные были разделены на 3 группы: первая - контрольная и две -опытные. Вторая группа - площадь ожога до 20 % от поверхности тела, 1-2 степень; третья группа -до 40 %, 3-4 степень тяжести. Сроки наблюдения: 1-е сутки - стадия ожогового шока, 3-и, 5-е сутки -стадия ожоговой токсемии.

Интенсивность свободно-радикального окисления в крови исследовали методом железо индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) плазмы на приборе ХЛ-003. Проверку стабильности работы прибора проводили по излучению эталона СФХМ-1 (ГОСТ 9411-81). Интенсивность свечения эталона составляла 5,1 ТО5 квантов в секунду. Данная величина была принята за одну условную единицу. Плазму крови готовили, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Перед измерением свечения 0,5 мл плазмы разводили в 18,5 мл солевого раствора следующего содержания: 20 мМ КН2РО4, 105 мМ КС1, величину pH которого доводили до 7,45 ед. Свечение индуцировали добавлением 1 мл FeSO4-7H2O, оптимальная концентрация которого составила 2,5 мМ в среде инкубации. Метод железо индуцированной ХЛ позволяет оценить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Учитывали следующие показатели ХЛ: спонтанное свечение плазмы (СП), амплитуду быстрой вспышки (А), светосумму свечения (S).

Диеновые конъюгаты (ДК) определяли экстракцией в среде хлороформ-метанол [20]. ТБК-активные продукты определяли по образованию окрашенного продукта в реакции с тиобарбитуро-вой кислотой [21].

Концентрацию фракции с молекулярной массой от 500 до 5000 дальтон определяли измерением оптической плотности плазмы крови при длине волны 254 нм [18]. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows» [10, 17]. Для описания результатов использовали М-среднее значение признака, т-стандартную ошибку среднего, s-среднее квадратичное отклонение, характеристику выборки пред- ставляли в формате М +_ш. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрических (Стьюдента) и непараметрических (Манна-Уитни) критериев. Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования

Исследование природы ХЛ плазмы и сыворотки крови, развивающейся при добавлении солей двухвалентного железа, показало, что при наличии гидроперекисей липидов ионы железа реагируют с ними с образованием перекисных радикалов. Доказательством связи железо индуцированной ХЛ со свободно-радикальным окислением липидов служит параллелизм между интенсивностью свечения, потреблением кислорода и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, в частности, малонового диальдегида и диеновых конъюгатов [3, 7, 14]. Переход свечения из одной фазы в другую зависит от стадий окисления. Амплитуда быстрой вспышки определяется содержанием в крови гидроперекисей липидов и скоростью окисления ионов двухвалентного железа. Начало медленной вспышки вызвано свободнорадикальным окислением липидов, главным образом, суммарной фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности [5, 6, 22]. Их увеличение в крови или структурные изменения молекул ведут к возрастанию свечения [9]. Выравнивание скорости образования и распада гидроперекисей становится причиной перехода медленной вспышки в стационарное свечение.

Таким образом, спонтанное свечение (СП)

плазмы крови характеризует интенсивность перекисного окисления без вмешательства извне; амплитуда быстрой вспышки (А) - наличие в крови гидроперекисей липидов; светосумма свечения (S) — количество и способность липидов крови подвергаться окислению.

Запись стандартной хемилюминограммы представлена на рис. 1.

При анализе ХЛ плазмы крови учитывали следующие показатели - спонтанное свечение (СП), амплитуду быстрой вспышки (А) и светосумму свечения медленной вспышки (S).

Показатели ХЛ плазмы и содержание в крови продуктов перекисного окисления липидов при термической травме представлены в таблице.

Независимо от тяжести ожоговой травмы регистрируется активация свободно-радикального окисления, что подтверждается достоверным возрастанием относительно контроля СП и ДК во все сроки исследования. Но СП на всех сроках исследования была достоверно ниже при ожогах 3-4 степени тяжести относительно ожогов 1-2 степени.

Количество ДК и ТБК-активных продуктов на 1-е и 5-е сутки ожоговой травмы выше при ожогах 3-4 степени тяжести относительно ожогов 1-2 степени. Более того, количество ТБК — активных продуктов при ожогах 1-2 степени на 1,5 сутки не отличается от контрольных значений, а при ожогах 3-4 степени тяжести превосходит контрольные величины в 2 раза.

Таким образом, интенсивность и скорость свободно-радикального окисления выше при ожогах 3-4 степени тяжести, что подтверждается более низкими показателями СП на всех сроках на-

Рис. 1. Запись хемилюминесценции плазмы крови здорового человека: 1 - темновой ток; 2 - спонтанное свечение; 3 - быстрая вспышка; 4 - латентный период; 5 - медленная вспышка; 6 - стационарное свечение; 7 - светосумма хемилюминесценции

ХЛ плазмы и содержание в крови продуктов перекисного окисления липидов при термической травме (хемилюминесценция, усл. ед.)

Условия эксперимента	СП	А	S	ДК, ед.Е/мл	ТБК-АП, ед.Е/мл
Контроль 1 группа (п = 20)	3,13 ±0,2	75,1 ±2,5	21,4 ±0,3	0,09 ± 0,007	0,04 ±0,001
1 сутки 2 группа (п = 10)	6,4 ± 0,4 ***	74,9 ± 3,2	25,2 ± 0,5 ***	0,127 ±0,005 ***	0,04 ± 0,004
3 сутки 2 группа (п = 10)	8,2 ± 0,4 ***	98,6 ± 3,3 ***	29,6 ± 0,9 ***	0,14 ±0,007 ***	0,08 ± 0,005 ***
5 сутки 2 группа (п = 10)	5,6 ±0,5 ***	84,31 ±3,1 *	25,0 ± 0,4 ***	0,118 ±0,005 ***	0,05 ± 0,004
1 сутки 3 группа (и = 10)	4,3 ±0,2 *** ▼ ▼▼	71,9 ±3,8	27,2 ± 0,6 ***	0,15 ± 0,005 *** ▼ ▼▼	0,066 ± 0,006 *** ▼ ▼▼
3 сутки 3 группа (п = 10)	4,4 ± 0,3 ** * ▼ ▼▼	65,7 ±2,1 *** ▼ ▼▼	17,1 ±0,4 *** ▼ ▼▼	0,13 ±0,004 ***	0,08 ± 0,003 ***
5 сутки 3 группа (п = 10)	3,8 ± 0,2 * ▼ ▼▼	55 ± 1,9 *** ▼ ▼▼	15,6 ±0,4 *** ▼ ▼▼	0,14 ±0,004 *** ▼ ▼▼	0,09 ± 0,005 *** ▼ ▼▼

Примечания: * - достоверность относительно контроля, ▼ - достоверность между 2 и 3 группой; количество знаков обозначает —р < 0,05; < 0,01; < 0,001.

блюдения (рис. 2), но достоверно более высокими величинами ДК и ТБК-активных продуктов на 1-е и 5-е сутки после травмы (рис. 3, 4).

Более низкие показатели спонтанной (СП) хемилюминесценции при ожогах 3^1 степени могут быть обусловлены - повышением скорости окисления на фоне истощения антиоксидантной защиты и (или) количественным снижением субстратов для окисления. В литературе указывается, что в период ожогового шока происходит активация процессов липолиза с увеличением количества триацилглицеринов и их переносчиков - липопротеинов очень низкой плотности; отмечается резкое торможение липогенеза, что проявляется в снижении уровня холестерина, липопротеинов высокой плотности и липопротиенов низкой плотности; разобщение всех звеньев липидного обмена - синтеза, транспорта, снижение периода полужизни липидов [1].

При ожогах 3-4 степени тяжести содержание в крови гидроперекисей липидов было ниже, чем в группе контроля и ожогах 1-2 степени. Доказа-

Рис. 2. Показатели спонтанной хемилюминесценции после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента. По оси Y- интенсивность свечения, усл. ед.; по оси X - время, сут

Диеновые конъюгаты

Рис. 3. Содержание диеновых конъюгатов после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

Рис. 4. Содержание ТБК-активных продуктов после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

тельством являются различия по показателям амплитуды быстрой вспышки. Амплитуда быстрой вспышки (А) при ожогах 1-2 степени тяжести была выше контрольных значений на З-и-5-е сутки, при тяжелых ожогах амплитуда быстрой вспышки в эти же сроки снижалась относительно контроля и ожога 1-2 степени (рис. 5).

Светосумма свечения (S) возрастала на 1 сутки после ожоговой травмы независимо от степени поражения и оставалась выше контрольных значений при ожогах 1-2 степени на З-и-5-е сутки. При ожогах 3—4 степени тяжести светосумма свечения на 3-и, 5-е сутки была снижена не только относительно контроля, но и относительно ожогов 1-2 степени (рис. 6).

Тяжесть ожоговой травмы определяет динамику изменений показателей А и S. Амплитуда быстрой вспышки (А) и светосумма (S) свечения при ожогах 3—4 степени тяжести постепенно снижались и на 5-е сутки были ниже (р<0,001) относительно первых суток ожоговой травмы. Подобная закономерность отсутствует при ожогах 1-2 степени тяжести.

Более низкие значения амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения могут быть связаны с уменьшением количества легко окисляемых полиненасыщенных жирных кислот и накоплением в крови веществ подавляющих окисление. Указывается, что в крови пациентов при ожогах пре-

Рис. 5. Показатели амплитуды быстрой вспышки после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

Светосумма свечения

Рис. 6. Показатели светосуммы хемилюминесценции после термической травмы на 1-5-е сутки эксперимента

тяжёлая степень тяжести

Рис. 7. Изменение содержания молекул средней молекулярной массы при термической травме разной степени тяжести. По оси Y - содержание МСММ в плазме крови, ед. оптической плотности; по оси X -время, прошедшее после нанесения термической травмы, сут обладают насыщенные или моноеновые жирные кислоты, необходимые для устранения дефицита энергии, а полиеновые жирные кислоты используются в качестве пластического материала для синтеза гормонов [12]. При выраженной токсемии отмечается увеличение молекул средней молекулярной массы от 500 до 5000 тысяч дальтон -(МСММ), которые способны подавлять перекисное окисление липидов [19].

Установлены различия в динамике и количественном представительстве средних молекул при ожоговой травме различной степени тяжести (рис. 7).

При 1-2 степени термической травмы количество средних молекул возрастало не более чем в 1,5 раза к 3-5-м суткам. В случаях 3-4 степени происходило более быстрое (на 2-е-З-и сутки) и более интенсивное (в 3-4) раза нарастание средних молекул.

При ожогах 1-2 степени тяжести нет соответствия динамики изменения светосуммы и МСММ (рис. 8) и отсутствует корреляция между этими показателями.

При термической травме 3-4 степени тяжести изменения этих показателей противоположны (рис. 9) и существует достоверная отрицательная связь (г - 0,78).

0,45

0,4

0,35

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

-*- Светосумма (У-е)

—♦—МСММ (у.е. 0254)

1 сутки

3 сутки

5 сутки

Ожог 1-2 степени тяжести

Рис. 8. Динамика изменений светосуммы свечения и молекул средней молекулярной массы при термической травме 1-2 степени тяжести

Рис. 9. Динамика изменений светосуммы свечения и молекул средней молекулярной массы при термической травме 3-4 степени тяжести

120 - 100 - 80 - 60 - 40 - 20 0 -	■ ... -------------- "	г 0,45 - 0,4 - 0,35 - 0,3
		- 0,25 - 0,2 -^МСММ (у.е. D254)
		- 0,15 - 0,1 - 0,05 - 0
	1 сутки      3 сутки       5 сутки ожог 1-2 ст.

Рис. 10. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (А) и молекул средней молекулярной массы при термической травме 1-2 степени тяжести

—в—А

-♦—МСММ (у.е. D254)

ожог 3-4 ст

Рис. 11. Динамика изменений амплитуды быстрой вспышки (А) и молекул средней молекулярной массы при термической травме 3-4 степени тяжести

Точно такая же закономерность установлена и для амплитуды быстрой вспышки (рис. 10, 11).

Таким образом, при термической травме 3-4 степени снижение амплитуды быстрой вспышки и светосуммы свечения может быть связано с нарастанием в крови молекул средней молекулярной массы.

Выводы

• 1.    Установлено, что в крови при термической травме активируется свободно-радикальное окисление.

• 2.    Интенсивность свободно-радикального окисления зависит от тяжести термической травмы.

• 3.    Для стадии ожоговой токсемии при термической травме 3-4 степени тяжести характерно снижение в крови гидроперекисей липидов и интенсивности окисления липидов.